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柑桔（Citrus L.）是当今世界最重要的水果之一,也是我国南方最重要的经济果树。柑桔是多年生木本果树,以往的常规育种由于存在童期长、遗传高度杂合性和多胚现象,使得柑桔育种工作困难重重。近年来,不断完善的转基因技术为我们提供了新的育种和品种改良手段。目前,转基因作物的安全性问题受到极大关注。利用遗传转化技术改良柑桔品种首先要考虑生物安全性问题,使用安全的选择标记基因是有效方法之一。本实验以福建传统优良甜橙品种雪柑（C. sinensis L.Osb.）为材料,在初步建立以PMI（Phospho-mannose-isomerase,磷酸甘露糖异构酶）基因为选择标记转基因体系基础上,进一步优化转化体系;同时将拟南芥LEAFY基因以及龙眼LEAFY同源基因LLFY分别导入雪柑,以期培育童期短的雪柑新品系并研究LLFY基因的功能;本实验还对农杆菌介导的“针刺”法进行了探索研究,为柑桔和木本植物的转基因研究提供了新的思路。主要研究结果如下:1.以PMI基因为选择标记雪柑遗传转化体系的优化。通过对影响转化的各种因素的优化实验建立了雪柑以PMI基因/甘露糖选择标记系统的高效遗传转化体系。实验结果表明,在菌液OD600为0.6,1mg·L-1 2,4-D预处理3h,农杆菌侵染30min,4d的共培养时间,选择压为甘露糖20g·L-1的情况下大大提高了转化后的再生率,而在筛选培养基中加入2mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA的情况下有助于抗性大苗的筛选。2. LFY和LLFY基因导入雪柑的研究。以优化的条件为转化体系,将拟南芥LEAFY基因以及龙眼LEAFY同源基因LLFY分别导入雪柑中,获得转基因植株。研究表明,抗性芽在附加20g·L-1甘露糖和10g·L-1蔗糖的壮苗培养基中能够有效快速淘汰假阳性抗性芽;通过CPR和PCR检测, LFY和LLFY基因的大苗转化率分别为:3.7%和7.4%;通过滤纸桥生根法对转基因芽进行了生根,获得完整植株并移栽成功。3.农杆菌介导“针刺法”LFY基因转化雪柑的研究。以雪柑种子为外植体,以pC1301-PMI-LFY重组载体为转化载体,将蘸有农杆菌侵染液的接种针在种子胚的顶端分生组织部位刺23次,深度1mm左右,当实生苗成活后移栽。通过PCR检测和PCR-Southern杂交检测得到了1株转基因植株,转化率为4.35%。针刺法简便快速,在雪柑上能够成功应用,为木本植物的遗传转化提供了新的思路。4.龙眼LFY同源基因LLFY和SLLFY植物表达载体的构建。将红核子龙眼LLFY基因插入载体pC2300-35S-OCS的35S启动子和OCS终止子之间,构建了pC2300-35S-LLFY-OCS植物表达载体;将四季蜜龙眼SLLFY基因插入载体pC2300-35S-OCS的35S启动子和OCS终止子之间,构建了pC2300-35S-SLLFY-OCS植物表达载体,为研究这两个基因的功能创造条件。