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氧化应激是细胞和组织的氧化和抗氧化系统之间失去平衡的状态,导致氧化过量产生自由基和活性氧（ROS）。过量产生的ROS可能攻击细胞蛋白质,脂质和核酸,导致细胞功能障碍,包括能量代谢丧失,细胞信号传导和细胞周期控制改变,基因突变,细胞转运机制改变,生物活性降低,免疫激活和炎症。生物体内氧化-抗氧化平衡系统可以调整氧化应激状态。内源性抗氧化剂主要包括几种酶类抗氧化剂,如谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）,超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）。生物体内几种抗氧化酶协同作用,维持ROS在稳定水平。对于谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）,大部分高活性的GPx是含硒酶,催化活性中心硒代半胱氨酸Sec由终止密码子UGA编码,所以需要特殊的机制将Sec掺入到蛋白质中,由于真核和原核生物在插入机制上有所不同,因此使用传统的基因重组技术表达含硒GPx较为困难。由于GPx是一种重要的含硒抗氧化酶,许多研究人员制备了GPx模拟物,但在活性以及制备方法上存在一定局限性。本实验采用的是Cys缺陷型大肠杆菌表达系统,这是近年来被发现制备硒蛋白的有效办法,它的基本原理是利用Cys转运RNA（tRNACys）可以结合Sec这一特性,用缺少Cys而富含Sec的培养基培养菌种,使Sec成功掺入新表达的蛋白中。为了更高效的表达重组蛋白,本实验同时采用了SPP表达系统,这一系统可通过浓缩培养基降低成本同时保证蛋白表达产量。联合使用Cys缺陷型大肠杆菌表达系统和SPP系统,我们在逐步提高硒蛋白的生产效率。为了更好的研究各种抗氧化酶在体内的协同作用,增加抗氧化酶的活力,我们同时表达了超氧化物歧化酶（SOD）,制备出了含有GPx活力和SOD活力的双功能酶。为了制备具有GPx2和ApSOD活性的双功能抗氧化酶,我们选择了一段柔性肽（GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer）作为连接linker,把胃肠型谷胱甘肽过氧化物酶GPx2和ApSOD基因共同连接在一起克隆到pColdI表达载体上,使用Cys缺陷型大肠杆菌表达系统直接制备重组GPx2-linker-ApSOD蛋白。（1）编码双功能酶的基因序列的设计我们选用了一段柔性肽作为linker,连接GPx2基因和ApSOD基因,成功获得了能够融合GPx2和ApSOD的编码基因。（2）构建pColdI-GPx2-linker-ApSOD质粒设计引物,将linker用PCR的方法连接到GPx2上,获得GPx2-linker基因,再用PCR的方法,同时构建linker-ApSOD。最后使用重叠PCR得到GPx2-linker-ApSOD整个片段。再用内切酶NdeI和XbaI同时将目的基因GPx2-linker-ApSOD和载体pColdI酶切,酶切后使用连接酶将二者连接,构建出pColdI-GPx2-linker-ApSOD基因。将基因转化到DH5α菌中并提取质粒。（3）表达pColdI-GPx2-linker-ApSOD蛋白并纯化将pColdI-GPx2-linker-ApSOD质粒和pMzaF质粒转化到BL21（DE3）Cys缺陷型大肠杆菌中,获得缺陷型表达菌pColdI-GPx2-linker-ApSOD。在培养时加入Sec,使其成为含硒蛋白。使用Ni2+柱螯合层析纯化目的蛋白,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱杂蛋白,最终获得目的蛋白。（4）对pColdI-GPx2-linker-ApSOD蛋白的GPx和SOD活力的测定通过多次活力测量,pColdI-GPx2-linker-ApSOD的SOD活力为109.3±11.0U/mg,它的GPx活力为3.7±0.4 U/mg。综上,本实验成功构建了具有GPx2和ApSOD活性的双功能酶,这种基因工程构建双功能酶的方法不仅解决了天然抗氧化酶来源有限的问题,而且生产成本降低,蛋白产率增加,活力增加,同时也为日后研究各种抗氧化酶协同作用机制的研究打下良好的基础。