论文部分内容阅读
微管是由α/β微管蛋白(α/β-tubulin)聚合成的中空管状结构，是真核细胞骨架的重要组成部分。微管在细胞分裂、细胞运动、胞内运输和细胞形态维持等生物学过程中发挥重要作用。对于极性的神经元而言，微管除了为轴浆运输提供轨道，还参与神经元生长锥的运动、突起的生长、分支的形成、树突嵴的重塑等重要过程。微管蛋白的翻译后修饰以及催化其反应的酶对微管的细胞生物学功能起着重要的调控作用。 目前研究比较多的微管蛋白翻译后修饰有乙酰。早在七十年代就已经发现了α-tubulin上存在乙酰化修饰，但直到2010年才发现了α-tubulin主要的乙酰化酶MEC-17(mchanosensory abnormality-17)。与α-tubulin乙酰化修饰一样，MEC-17在脊椎动物神经系统中高度富集，提示它在神经系统功能中起到调控作用。已有研究表明，MEC-17的缺失导致线虫神经元中微管原纤维数目的异常和机械感觉功能障碍，另有报道MEC-17参与神经元轴突的维持。我们实验室之前发表的工作也证明，MEC-17对于大鼠皮层神经元的迁移是必需的，但是MEC-17及微管蛋白的乙酰化修饰在微管功能调控和哺乳动物神经元形态生成中的作用尚不清楚。另外，虽然α-tubulin的乙酰化修饰一直被认为是稳定微管的标记物，但是目前关于α-tubulin的乙酰化对于微管动态性的直接影响仍有争议。 我们成功地获得了MEC-17敲除小鼠，证实了MEC-17是小鼠中主要的α-tubulin乙酰化酶。我们观察到MEC-17与细胞中F-actin存在共定位现象，但是同位素标记的体外乙酰化实验结果表明MEC-17并非actin的乙酰化酶。通过活细胞成像实验和nocodazole处理实验，我们发现在MEC-17敲除小鼠的胚胎成纤维细胞和海马神经元中微管的动态性和不稳定性显著增加。同时，我们还发现MEC-17缺失导致体外培养的海马神经元表现出轴突分支显著增加和生长增强的现象。旷场实验、明暗箱实验和高架迷宫实验的结果显示，MEC-17敲除小鼠的焦虑水平与野生型相比明显升高，转棒实验显示MEC-17敲除小鼠的运动能力没有受到影响，水迷宫实验的结果表明MEC-17敲除小鼠的空间学习记忆功能与野生型小鼠相比也并无明显改变。上述结果表明MEC-17分子对中枢神经系统功能有重要的调节作用。 生化实验的结果表明，MEC-17乙酰化活性与结合α-tubulin的功能在结构上相互独立:MEC-17分子的N端（1-193氨基酸）具有对α-tubulin的乙酰化功能，其中第183位苯丙氨酸(Phenylalanine，F)是影响MEC-17乙酰化催化能力的主要位点;C端（194-333氨基酸）负责与α-tubulin的相互作用，其中291-302段序列是MEC-17结合α-tubulin的最短片段。进一步的研究表明，MEC-17调控微管动态以及约束神经元分支与生长的作用依赖于对α-tubulin的乙酰化能力而非结合能力。在MEC-17缺失的细胞或神经元中过表达野生型MEC-17-GFP或MEC-171-193-GFP可以恢复微管的过度动态性，同时抑制MEC-17敲除神经元的过度分支与生长;但是过表达无乙酰化活性的MEC-17F183A和MEC-17194-333无法恢复微管动态不稳定性的增加，也不能挽回MEC-17敲除神经元过度分支与生长的表型。神经元生长实验结果显示，通过taxol处理降低MEC-17缺失的海马神经元中微管的动态不稳定性，可以抑制MEC-17敲除引起的轴突分支与生长异常，说明MEC-17介导α-tubulin乙酰化通过维持微管合适的动态稳定性调控了神经元的形态。此外，体外微管聚合沉淀实验与免疫共沉淀实验表明，MEC-17缺失导致微管相关蛋白tau与微管和α-tubulin的结合下降，提示α-tubulin乙酰化可能通过影响微管相关蛋白的结合调控微管的动态性质。 综上所述，我们的研究揭示了MEC-17通过乙酰化α-tubulin，维持了微管网络适度的动态性，最终限制了海马神经元的过度分支与生长，维持了中枢神经系统的正常功能。该工作阐述了MEC-17对神经元功能的调节作用，揭示了MEC-17实现功能的分子基础，拓展了对微管蛋白的翻译后修饰调控神经元形态的理解。