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研究背景和目的：经过20多年的发展,肝细胞移植作为肝移植的替代疗法,已经成为一种治疗急、慢性肝功能衰竭和肝脏相关遗传代谢疾病的有效方法。但是目前肝细胞移植仍面临许多问题,如肝细胞的来源短缺、移植细胞数量有限、肝细胞移植后的增殖、受损肝细胞的替代程度及免疫排斥等诸多问题。2002有人报道,BMSC可以在体外诱导成肝细胞。而BMSC以自身独特优点有望使细胞移植在肝病治疗方面取得实质性的突破,临床应用前景突出。本实验室已经掌握各种方法诱导BMSC向肝细胞分化,并取得了成功。为了临床应用方便,我们探讨了更简单、可控、成分明确的培养方法。我们用人血清白蛋白代替了FBS,用无血清的培养方法来提供肝细胞移植临床应用更好的细胞来源。肝脏生理功能的实现有赖于肝细胞极化的形成和维持。但是,目前我们对肝细胞极化的认识非常有限。肝细胞极化研究在很大程度上受限于缺乏理想的体外肝细胞极化模型。因此我们应用了骨髓间充质干细胞来源的肝细胞,对体外肝细胞的极化进行了研究。以便用骨髓间充质干细胞来源的肝细胞建立良好的体外肝细胞极化模型。熊去氧胆酸(UDCA)具有利胆、抗肝细胞凋亡和拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性等多种作用,在临床上用于治疗肝胆系统多种疾病。但目前对UDCA细胞内作用机制认识有限,UDCA对肝细胞极化的调节作用尚缺少研究。本研究选择了SR-B1、MRP2和NTCP三个极化分子进行检测,来研究UDCA在mRNA水平对肝细胞极化分子表达的调节作用的作用。实验方法：1.提取成人骨髓间充质干细胞在无血清培养下向肝细胞诱导分化。通过与有血清诱导分化组和非诱导分化组比较,使用光学显微镜观察细胞分化0天、7天、14天、21天的细胞形态；使用白蛋白生化检测试剂盒检测肝细胞特异性标记物ALB的蛋白表达；使用免疫荧光染色,荧光显微镜下观察白蛋白在肝细胞内的合成、分布情况,观察无血清培养诱导的肝细胞是否具有与有血清诱导分化组细胞相似的成熟肝细胞的特征。2.使用实时定量PCR方法来检测分化7天、14天、21天和最后7天加用50μmol/L UDCA(21+U组)诱导的肝细胞的MRP2、NTCP、SR-B1三个极化分子的表达；使用免疫荧光染色方法在共聚焦显微镜下观察MRP2、SR-B1在细胞上的定位,以此观察骨髓间充质干细胞相肝细胞诱导分化过程中MRP2、NTCP、SR-B1的mRNA表达和MRP2、SR-B1的定位情况。研究结果：1.成人骨髓间充质干细胞在无血清培养下诱导分化21天后具有成熟肝细胞形态(无血清诱导分化组,A组),与非诱导分化组(C组)差别明显,而与有血清的诱导分化组(B组)相近。分别检测三组细胞的白蛋白表达,在分化7,14,21天的A组和B组白蛋白逐渐升高,14天后维持在较高水平,三个时间点A组和B组白蛋白表达量明显高于C组(p<0.05)。A组和B组细胞在诱导分化14天后,白蛋白免疫荧光染色发现,细胞内有大量点状、颗粒状或者均匀分布的绿色荧光,较自身未加一抗的对照及C组比较明显为阳性。2.实时定量PCR检测分化7天、14天、21天和最后7天加用50μmol/L UDCA(21+U组)诱导的肝细胞的MRP2、NTCP、SR-B1极化分子的mRNA表达发现,7天、14天、21天和21+U组四组细胞MRP2、NTCP、SR-B1的mRNA表达随时间增加而升高,14天、21天组明显高于7天组(p<0.05),21+U组明显高于21天组(p<0.05)。免疫荧光染色显示细胞诱导14天后MRP2、SR-B1两种极化蛋白分别定位于肝细胞膜的不同部位,呈现明显的极化特征,而对照组细胞未观察到特异性分布。研究结论：1.无血清条件下培养骨髓间充质干细胞在特定诱导因子下可以分化为有一定功能的肝细胞,与诱导分化培养基诱导的肝细胞类似。从而为肝细胞临床移植准备了的良好的细胞来源。2.成人骨髓间充质十细胞具有向极化肝细胞分化的潜能。骨髓问充质十细胞分化的肝细胞可以作为研究肝细胞极化形成和调节机制的良好模型。UDCA可以促进肝细胞极化分子的表达。