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目的：ZDT-4是从药用植物栀子中提取分离出的一种新的单体成分，以往本实验室曾对其体外抗病毒作用进行过初步筛选，证明ZDT-4在体外对包括流感病毒FM1株及乙型肝炎病毒HBV等多种病毒均具有一定的抑制作用。本课题分别采用HePG2.2.15细胞模型、鸭乙肝动物模型、HBV转基因小鼠模型，进行体外、体内实验，通过考察比对给药组与模型对照组及阳性药物组间检测指标的有效性差异，对栀子提取物单体ZDT-4抗乙型病毒性肝炎作用进行全面、系统的体内外药效学评价，并对其抗HBV病毒作用机制进行深入的研究，为临床治疗乙型病毒性肝炎的新药研发提供试验依据。 方法及结果 1.体外药效学实验实验体外实验采用HepG2.2.15细胞，以拉米夫定为阳性药物，设计相应的药效学试验。首先进行各组药物对细胞的毒性试验，找出最大无毒浓度，计算出半数细胞有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。采用最大无毒浓度及该浓度以下的三个二倍稀释浓度进行实验，通过考察比对给药组与模型对照组及阳性药物组间检测指标的有效性差异，对栀子提取物单体ZDT-4抗乙型病毒性肝炎作用进行全面、系统的体内外药效学评价，检测指标为各给药组及对照组细胞分泌上清液的HBsAg、HBeAg及HBV-DNA含量;结果显示: (1)细胞毒性:栀子提取物ZDT-4给药组在HepG2.2.15细胞培养中的细胞毒性TC0为100 ug/ml，拉米夫定对照组TC0为8×10-6mol/L。 (2)HBsAg:阳性药物拉米夫定组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01);栀子提取物ZDT-4对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg具有降低作用，并且降低作用呈剂量依赖性，ZDT-4的100ug/ml剂量组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)。 (3)HBeAg:阳性药物拉米夫定组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01);栀子提取物单体ZDT-4对HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg具有降低作用，并且降低作用呈剂量依赖性，ZDT-4的100ug/ml剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。 (4)HBV-DNA:阳性药物拉米夫定组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，栀子提取物单体ZDT-4对HepG2.2.15细胞HBV-DNA分泌有明显抑制作用，并且抑制作用呈剂量依赖性，ZDT-4的100ug/ml、50ug/ml剂量组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01); ZDT-4的25ug/ml剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。 2.体内药效学实验-鸭乙型肝炎动物模型采用北京雏鸭乙型肝炎动物模型，观察栀子提取物单体ZDT-4体内抗鸭乙型肝炎病毒的作用。试验中ZDT-4给药组采用三个剂量:873.6mg.Kg-1.D-1、438.2mg.Kg-1.D-1、219.1mg.Kg-1.D-1。将实验动物随机分为病毒对照组、阳性对照药物拉米夫定组、栀子提取物ZDT-4高、中、低剂量组，共5组，每组8只。除病毒对照组给予生理盐水外，其余各组均按设定剂量灌胃给药，给药体积为0.2ml/10g体重/d，一天2次，连续10天，检测用药前(T0)、用药后(T5、T10)及停药后(P3)血清中DHBV-DNA病毒滴度、病毒载量、ALT和AST的改变情况。鸭肝组织切片、包埋、HE染色，观察病理改变。结果显示: (1)斑点杂交法检测鸭血清DHBV-DNA滴度:模型对照组从感染DHBV病毒后0-13天内，血清DHBV-DNA水平一直很稳定的维持在一定水平，说明本实验鸭乙肝病毒肝炎模型造模成功;拉米夫定对照组用药后，血清DHBV-DNA水平明显下降，在用药后第五天(T5)和第十天(T10)与模型对照组比较均具有极显著差异(P＜0.01)，且随着用药时间延长血清DHBV-DNA水平持续下降，在(T10)达到最低值，但停药后(P3)血清DHBV-DNA水平出现明显反弹(P＞0.05);栀子提取物单体ZDT-4在用药期间，大、中、小剂量对血清DHBV-DNA水平均具有降低作用，且降低作用呈剂量和时间依赖性，随着给药剂量加大、给药时间延长，对血清DHBV-DNA水平的降低作用越明显，ZDT-4大、中剂量组在用药后第五天(T5)和第十天(T10)与模型对照组比较均具有极显著差异(P＜0.01)，在停药后(P3) ZDT大、中、小剂量组DHBV-DNA水平均未出现反弹，与模型组比较，ZDT-4大剂量组(P＜0.01)，中剂量组(P＜0.05)。 (2)荧光定量PCR法检测鸭血清DHBV-DNA病毒载量:模型对照组从感染DHBV病毒后0-13天内，血清LogDHBV-DNA值一直很稳定，维持在7.82±0.02水平;拉米夫定对照组用药后，血清DHBV-DNA含量明显下降，在用药后第五天(T5)和第十天(T10)与模型对照组比较均具有极显著差异(P＜0.01)，且随着用药时间延长血清DHBV-DNA含量持续下降，在(T10)达到最低值，但停药后(P3)血清DHBV-DNA含量出现明显反弹(P＞0.05);栀子提取物单体ZDT-4在用药期间，大、中、小剂量对血清DHBV-DNA含量均具有降低作用，且降低作用呈剂量和时间依赖性，随着给药剂量加大、给药时间延长，对血清DHBV-DNA水平的降低作用越明显，ZDT-4大、中剂量组在用药后第五天(T5)和第十天(T10)与模型对照组比较均具有极显著差异(P＜0.01)，在停药后(P3) ZDT大、中、小剂量组DHBV-DNA均未出现反弹，与模型组比较，ZDT-4大、中剂量组(P＜0.01)。 (3)鸭血清中ALT含量检测:模型对照组从感染DHBV病毒后0-13天内，血清中ALT含量随时间增长持续增加，在停药后3天(P3)达到最大，提示模型组动物，由于感染病毒，鸭肝组织细胞损伤程度随时间增长而逐渐加重;拉米夫定对照组在给药第5天(T5)和第10天(T10)与模型组比较均可降低血清中ALT含量，且均具有显著性差异(P＜0.05)，但其对ALT的抑制率不如同时间的ZDT-4大、中剂量给药组，且在停药后(P3)，ALT含量出现明显反跳;栀子提取物单体ZDT-4大、中、小剂量给药组与同时间点模型对照组比较，ALT含量均有所降低，且ZDT-4大、中剂量组在给药后5天(T5)与模型对照组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)，在给药后10天(T10)与模型对照组比较，ZDT-4大剂量组(P＜0.01)，中剂量组(P＜0.05)。在ZDT-4停药后(P3)与模型对照组比较，仍具有显著性差异，ZDT-4大剂量组(P＜0.01)，中剂量组(P＜0.05)。 (4)鸭血清中AST含量检测:模型对照组从感染DHBV病毒后0-13天内，血清中AST含量随时间增长持续增加，在停药后3天(P3)达到最大，提示模型组动物，由于感染病毒，鸭肝组织细胞损伤程度随时间增长而逐渐加重;拉米夫定对照组可降低血清中ALT含量，在给药第10天(T10)与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)，但其对ALT的抑制率较同时间的ZDT-4大、中剂量给药组差很多，甚至不如ZDT-4小剂量给药组，且在停药后(P3)，AST含量出现明显反跳;栀子提取物单体ZDT-4大、中、小剂量给药组与同时间点模型对照组比较，AST含量均有所降低，且ZDT-4大剂量组在给药后5天(T5)和第10天(T10)与模型对照组比较，均具有极显著性差异(P＜0.01)，ZDT-4中剂量组在给药后5天(T5)和第10天(T10)与模型对照组比较，具有显著性差异(P＜0.01)。在停药后(P3)，ZDT-4各给药组鸭血清中AST均未出现反跳，与模型对照组比较，仍具有显著性差异(P＜0.05)。说明栀子提取物单体ZDT-4可改善DHBV模型雏鸭血清生化学指标，在体内具有保肝降酶作用，且不会出现停药反跳现象。 (5)病理切片:模型对照组鸭肝细胞有轻度的混浊肿胀，呈现气球样变，汇管区可见轻度炎症细胞浸润，并可发现少量点状或者灶状坏死，且伴有轻度肝组织纤维化，肝窦充血扩张，鸭肝炎症比较明显;栀子提取物单体ZDT-4大、中、小剂量给药组未发现点、灶状坏死，无纤维化现象，与模型对照组比较，炎症明显减轻;而拉米夫定给药组与模型对照组比较，肝脏病理组织学变化无显著差异，提示虽然阳性药物拉米夫定可明显降低鸭血清中DHBV-DNA含量，却对鸭肝组织并无保护作用，而栀子提取物单体ZDT-4对鸭肝组织病变具有改善作用。 3.体内药效学实验-HBV转基因小鼠模型体内实验采用HBV转基因小鼠作为受试动物[7]，以拉米夫定为阳性药物，设计相应的药效学试验，通过考察比对给药组与模型对照组及阳性药物组间检测指标的有效性差异，对栀子提取物单体ZDT-4抗乙型病毒性肝炎作用进行药效学评价，将转基因小鼠分为模型对照组、拉米夫定阳性对照组、栀子提取物ZDT-4高、中、低剂量组，共5组，每组5只。于分组后第二天，各给药组进行灌胃给药。连续给药22天，对各组转基因小鼠进行眼眶取血、解剖摘取肝脏，对小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBV-DNA含量进行检测，结果显示: (1) HBsAg:拉米夫定阳性对照组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01);栀子提取物ZDT-4对HBV转基因小鼠血清中HBsAg具有降低作用，并且降低作用呈剂量依赖性，ZDT-4大剂量组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)，ZDT-4中剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。 (2) HBeAg:拉米夫定阳性对照组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01);栀子提取物ZDT-4对HBV转基因小鼠血清中HBeAg具有降低作用，并且降低作用呈剂量依赖性，ZDT大剂量组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01)。 (3) HBV-DNA:拉米夫定阳性对照组与模型对照组比较有极显著性差异(P＜0.01);栀子提取物ZDT-4对HBV转基因小鼠血清中HBV-DNA具有降低作用，并且降低作用呈剂量依赖性，ZDT320mg/kg和160mg/kg剂量组与模型对照组比较均有极显著性差异(P＜0.01)。 (4)病理检查结果显示: 模型对照组HBV转基因小鼠肝细胞肝小叶结构完整，汇管区可见，肝细胞索排列整齐，肝细胞边界清晰，胞浆紧密、饱满，并无明显病变或炎症细胞浸润，未发现点、灶状坏死，无纤维化现象;栀子提取物单体ZDT-4大、中、小剂量给药组与模型对照组类似，也无任何肝脏病理性改变现象;拉米夫定给药组小鼠肝脏切片却呈现出轻度病理性改变，肝索紊乱，肝窦略扩张，肝细胞水肿，增大，呈多边形，细胞边界不清，胞浆疏松、稀少，有轻度的混浊肿胀，显著者呈气球样变，部分肝细胞脂肪变性，胞质内出现脂滴，未发现点、灶状坏死，无纤维化现象。本实验结果显示，栀子提取物单体ZDT-4个剂量给药28天，并未对小鼠肝脏产生损伤，说明ZDT-4本身对肝脏并无毒性作用，没有因为长期给药而对小鼠肝脏产生药物性肝损伤。拉米夫定给药组与模型对照组比较，肝脏病理组织学发生变化，提示虽然阳性药物拉米夫定可明显降低HBV转基因小鼠血清中HBV-DNA含量，却因长期用药，对小鼠肝组织产生药物性肝损伤。 4.ZDT-4抗乙肝作用机理研究HBV病毒与宿主的相互作用的过程中，宿主细胞内信号转导的关键酶-蛋白骼氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)参与了HBV的复制，抑制其活性就可能抑制乙肝病毒复制。为进一步探讨ZDT-4作用机理，采用HepG2.2.15细胞体外培养，观察ZDT-4对细胞内总PTK活性的影响。JAK(just another kinase或janus kinase)是一类非受体酪氨酸激酶家族，其中JAK-SATA途径对HBV病毒的复制起重要的调节作用。采用western boltting方法考察ZDT-4对在给药后不同时间点HepG2.2.15细胞JAK-STAT信号转导通路中关键蛋白JAK2含量及活性（磷酸化程度）的影响[8]，在分子水平深入探索栀子提取物单体ZDT-4抗HBV的作用机理[9]。首先选择TGF-β诱导JNK磷酸化的干预时间，综合考虑，实验选择了20min作为TGF-β磷酸化JNK蛋白的干预时间。ZDT-4给药组(100ug/ml)分别在加药10min、30min、60min、120min后，再加入5ng/mL的TGF-β取最佳诱导时间进行诱导磷酸化。然后收集细胞，用western blotting法测定磷酸化的JNK(p-JNK)含量，考察ZDT-4对HepG2.2.1.5细胞JAK2活性的影响。结果显示: (1) Elisa法检测PTK活性:栀子提取物单体ZDT-4对HepG2.2.15细胞内总蛋白酪氨酸激酶PTK具有明显降低作用，ZDT-4的100ug/ml剂量组与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。 (2) western boltting法检测JNK蛋白含量:与同时间模型对照组比较，栀子提取物单体ZDT-4在药物干预的不同时间段10min、30min、60min、120min，对JNK2的表达水平均并无明显影响(P＞0.05)。 (3) western boltting检测TGF-β诱导JNK蛋白磷酸化最佳时间:用TGF-β干预后，JNK磷酸化程度在10min时开始增强(P＜0.01)，20min达到最强(P＜0.01)，30min后开始随着时间的延长逐渐减弱(P＜0.01)，120min已经不能被检测出(P＞0.05)。综合考虑，实验选择了20min作为TGF-β磷酸化JNK蛋白的干预时间。 (4) western boltting法检测p-JNK蛋白含量:与TGF-β对照组比较，100ug/ml的ZDT-4在给药10min时还未开始对JNK的磷酸化起到抑制作用，在给药30min开始，ZDT-4+TGF-β组在之后的各干预各时间段均能显著抑制JNK磷酸化程度(P＜0.01)，提示ZDT-4可以抑制HepG2.2.15细胞中JNK蛋白的活性，其抑制作用从给药后30min开始，之后各时间段可持续发挥稳定的抑制作用。