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研究背景膀胱癌(Bladder cancer)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,属于全球发病率第9大癌症。据报统计每年全世界约有40万患者被诊断出患有膀胱癌,导致15万人死亡。膀胱癌的主要治疗方法包括外科手术结合放疗或化学疗法等。由于其高复发率和转移率,该病的5年生存率仍然很低。因此,明确膀胱癌进展的分子机制并开发新的治疗策略具有重要的社会价值。长链非编码RNA属于非编码RNA家族中的一员,其长度200个以上核苷酸。随着RNA-seq的广泛应用,在各种癌症中发现了成千上万的LncRNA的异常表达或突变。许多研究已经证实有些lncRNA的异常表达与肿瘤的进展有着密切的关系。在膀胱癌中已经发现了多种lncRNA发挥作用。长链非编码RNA SLC04A1-AS1(SLC04A1 antisense RNA1)属于溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员4A1(solute carrier organic anion transporter family member 4A1,SLC04A1)的反义RNA。膀胱癌中对SLC04A1-AS1的功能的研究却鲜有报道。本研究中,我们旨在研究SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能,并且寻找其可能靶向的miRNA以及可能介导的信号通路,探索其作为潜在的膀胱癌生物标志物和癌症治疗靶点的可能性,明确其在膀胱癌中的作用,为后期针对临床膀胱癌的诊断、防治提供新的思路及解决途径。研究目的1、探索其称为潜在的膀胱癌预后生物标志物的潜力。2、明确SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能。3、探索SLC04A1-AS1在LncRNA-miRNA-mRNA网络中的分子作用机制。研究方法第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究1、将58例临床病人的膀胱癌组织和癌旁正常组织,分别提取RNA,运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织中SLC04A1-AS1的表达水平。另外运用RT-qPCR分别检测人膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4,以及SV-HUC-1人膀胱上皮永生化细胞中SLC04A1-AS1的表达水平。2、收集膀胱癌病人的临床信息,随访时间等生存资料。将病人根据SLC04A1-AS1的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析,检验两组终点(生存期或生存率)的差异有无显著性。3、设计并合成SLC04A1-AS1的shRNA,利用慢病毒介导的RNA干扰技术在膀胱癌细胞EJ、T24中沉默(敲低)SLC04A1-AS1后观察膀胱癌细胞的表型的变化。进行CCK-8细胞活力检测,克隆形成实验和Transwell迁移和侵袭能力检测。4、利用裸鼠成瘤实验,观察沉默(敲低)SLC04A1-AS1后裸鼠体内膀胱癌生长的变化。第二部分SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系1、利用生物信息学分析 miRDB 数据库(http://mirdb.org/miRDB/index.html)预测 SLC04A1-AS1 的 miRNA。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、人膀肮癌细胞系中miR-335-5p的表达水平。3、将病人根据miR-335-5p的表达水平分为高表达组和低表达组,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平,进行了相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中SLC04A1-AS1的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默(敲低)SLC04A1-AS1后miR-335-5p的表达水平的变化。6、进行荧光素酶报告基因实验,验证SLC04A1-AS1和miR-335-5p是否互作。第三部分:SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达1、利用生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、膀胱癌细胞系OCT4的表达水平。3、将病人根据OCT4的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平,miR-335-5p与OCT4的表达水平,进行相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中OCT4的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默(敲低)SLC04A1-AS1后OCT4的表达水平的变化。6、荧光素酶报告基因实验检测包含OCT4 WT报告质粒或Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性以验证OCT4和miR-335-5p是否互作。7、在沉默SLC04A1-AS1的膀胱癌细胞EJ、T24中转染过表达OCT4质粒,观察并利用相关实验技术检测膀胱癌细胞的表型的变化包括细胞增殖、克隆形成、细胞的克隆形成能力。8、裸鼠成瘤实验,观察过表达OCT4和沉默SLC04A1-AS1同时处理的膀胱癌细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长变化。研究结果第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究RT-qPCR检测显示SLC04A1-AS1在膀胱癌组织中的表达水平异常升高,是癌旁正常组织的2.7倍,统计学分析显示具有显著性差异(P<0.05)。SLC04A1-AS1在三种膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4中表达也显著升高,分别是正常SV-HUC-1细胞中表达水平的3.84倍、4.37倍、2.05倍(P<0.05)。生存分析结果显示SLC04A1-AS1表达水平较高的患者,其总生存时间(Overall survival,OS)相对于SLC04A1-AS1表达水平较低者短;SLC04A1-AS1高表达组中位生存期(Median Survival Time)为40.3个月。表示膀胱癌者的总生存时间与SLC04A1-AS1表达有显著的负相关性。SLC04A1-AS1的表达水平和病人的年龄、性别等临床参数无关,和膀胱癌的病理T分期以及淋巴结转移呈现正相关。沉默SLC04A1-AS1(siSLC04A1-AS1)的EJ和T24的细胞活力显著降低,只有对照组的54.5%、52.2%(P<0.05)。在EJ和T24中沉默SLC04A1-AS1,细胞的克隆形成率显著降低,为对照组的37.07%、51.43%(P<0.05)。沉默SLC04A1-AS1后的胱癌细胞EJ和T24的迁移和侵袭数量也明显减少:沉默处理后的EJ的细胞迁移率为(55.33±10.26)%,为对照组的58.24%。沉默处理后的T24的细胞率迁移为(57.33±11.24)%,为对照组的54.08%(P<0.05)。在EJ细胞中SLC04A1-AS1沉默处理后的侵袭细胞数为(50.67±16.70)%,为对照组的52.23%。SLC04A1-AS1沉默处理后的T24的侵袭细胞数为(55±8.54)%,为对照组的59.35%(P<0.05)。裸鼠成瘤实验显示沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积在14天、21天、28天时比对照组裸鼠的膀胱癌体积更小;在28天时,对照组肿瘤体积是(672.67±97.90)mm3,沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是(306±66.78)mm3。在28天时沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是(329.33±130.70)mg,沉默组的肿瘤质量显著减小,为对照组的46.60%。第二部分:SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系生物信息学分析miRDB预测SLC04A1-AS1的靶向miRNA是miR-335-5p。miR-335-5p在膀胱癌组织和细胞系中低表达。miR-335-5p高表达组的总生存期比miR-335-5p低表达组的总生存期要长。miR-335-5p低表达组中位生存期为37.4个月。膀胱癌者的总生存时间与miR-335-5p表达有显著的正相关性。SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平之间呈负相关(Pearson r为-0.6522,95%C1 为-0.7793,-0.4737)。miR-335-5p mimics 转染后 EJ 细胞中的SLC04A1-AS1的表达水平显著下调,只有对照组的40.91%(P<0.05)。在T24细胞中也是同样的结果(P<0.05)。敲低SLC04A1-AS1后,EJ和T24细胞中miR-335-5p的表达水平升高,分别为对照组的4.07倍、2.95倍(P<0.05)。荧光素酶报告基因显示只有包含了 SLC04A1-AS1的WT报告质粒,细胞的荧光素酶活性才能被miR-335-5p mimics抑制。而miR-335-5p mimics转染对SLC04A1-AS1 Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性没有影响。第三部分SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因是OCT4。OCT4在膀胱癌组织和细胞系中高表达:膀胱癌组织中OCT4的表达水平更高,为对癌旁正常组织的2.43倍(P<0.05)OCT4在EJ、T24和RT4细胞系中表达也显著升高(P<0.05)。OCT4高表达组的总生存期(Overall survival,OS)比OCT4高表达组的总生存期要短(图20)。OCT4高表达组中位生存期(Median Survival Time)为41.3个月。膀胱癌者的总生存时间与OCT4表达有显著的负相关性(P<0.01)。SLC04A1-AS1与OCT4表达水平之间,表明SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平呈正相关(P<0.0001)。miR-335-5p与OCT4的表达水平呈显著负相关(P<0.0001)。上调miR-335-5p抑制OCT4的表达miR-335-5p mimics转染后EJ、T24细胞中的OCT4的mRNA表达水平显著下调(P<0.05)。在EJ和T24细胞中miR-335-5p mimics处理组的OCT4蛋白表达水平比对照组都显著降低。荧光素酶报告基因实验表明miR-335-5p直接与OCT4相互作用。沉默SLC04A1-AS1抑制OCT4的表达。过表达OCT4逆转SLC04A1-AS1沉默对膀胱癌细胞的影响:沉默SLC04A1-AS1(siSLC04A1)和 过 表 达 OCT4 同 时 处 理(siSLCO4A1-AS+oeOCT4)的细胞增殖则不受抑制;沉默SLCO4A1-AS1抑制了 EJ和T24细胞的克隆形成,而siSLCO4A1-AS+oeOCT4组细胞的克隆形成能力则被恢复。在T24细胞中siSLCO4A1组的细胞迁移率为(57.33±11.24)%,siSLCO4A1-AS+oeOCT4 组的 T24 的迁移细胞率为(107±5.29)%(P<0.05);siSLCO4A1-AS+oeOCT4组接近对照组的细胞迁移率(106±11.36)%。在T24细胞中siSLCO、siSLCO4A1-AS+oeOCT4组的细胞侵袭率为(55±8.54)%、(102±8.89)%,对照组的细胞侵袭率为(92±8.96)%。在EJ细胞中也是同样的结果。裸鼠动物实验显示si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4组的裸鼠膀胱癌生长速度比转染siSLC04A1-AS1组裸鼠的膀胱生长速度更快;在28天时,对照组肿瘤体积是(672.67±97.90)mm3,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是(306±66.78)mm3,si-SLC04A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是(597±106.38)mm3,为siSLCO4A1-AS1组的1.95倍,统计学分析显示两组有显著差异(P<0.05)。在28天时对照组裸鼠的肿瘤质量(706.67± 120.02)mg,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是(329.33± 130.70)mg,si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是(682.67±144.74)mg,为 siSLC04A1-AS1 组的 2.07 倍(P<0.05)。结论SLCO4A1-AS1在膀胱癌组织和细胞系中高表达,SLCO4A1-AS1表达水平和膀胱癌患者OS、T分期相关;沉默SLCO-AS1显著抑制膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,并且抑制体内肿瘤的生长。SLCO4A1-AS1靶向mi355-5p,并与其互作。SLCO4A1-AS1与miR-335-5p之间呈负相关。上调 miR-335-5p 抑制 SLCO4A1-AS1 的表达,敲低 SLCO4A1-AS1 上调miR-335-5p 的表达。OCT4 是miR-335-5p 的靶基因。上调 miR-335-5p 抑制 OCT4的表达。沉默SLCO4A1-AS1抑制OCT4的表达,也能被miR-335-5p逆转。过表达OCT4能逆转SLCO4A1-AS1沉默对膀胱癌细胞和肿瘤的抑制影响。总之,我们的研究是揭示了 SLCO4A1-AS1作为膀胱预后生物标志物的潜力,并且阐述了膀胱癌中SLC04A1-AS1通过miR-335-5p/OCT4发挥功能的作用,为今后针对SLCO4A1-AS1作为治疗靶点提供了新的证据和理论支持。