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哺乳动物循环系统中的类胰岛素生长因子(IGFs)几乎全部都高亲和力地与其结合蛋白(IGFBPs)家族成员结合。许多研究报道，IGFBPs不仅有依赖IGFs的行为，如转运IGFs，调节IGFs的生物利用率及活性，还具有与其细胞表面受体结合或进入细胞核内的不依赖于IGFs的独立作用。本研究首先利用同源克隆和RACE方法，从健康的鲤鱼肝脏中克隆得到鲤鱼IGFBP-1、—2和—3全长cDNA序列并进行分析；运用Northern blot对IGFBP-1、—2和—3基因在鲤鱼肝脏中的转录本情况进行了研究；同时通过半定量RT—PCR技术分析鲤鱼IGFBP-1、—2和—3在成体鲤鱼各组织中mRNA的表达情况；采用Real—time PCR技术检测了它们在胚胎、幼体不同发育阶段以及性腺不同发育阶段中的表达情况；利用鲤鱼肝细胞原代培养系统，研究了GH和insulin对鲤鱼IGFBP-1和—2基因表达的影响及其调控机制；最后克隆得到鲤鱼IGFBP-1、—2和.3-基因的上游启动子序列，并分析了其潜在的转录因子结合位点。主要研究结果如下：
1.本研究克隆的鲤鱼IGFBP-1 cDNA全长1655bp，含有一个长789bp的开放阅读框，编码一段由262个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼IGFBP—2 cDNA全长1879bp，开放阅读框为825bp，编码一段由274个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼IGFBP—3 cDNA全长1680bp，长约882bp的开放阅读框编码一段由293个氨基酸组成的前体蛋白。鲤鱼IGFBP-1、—2和—3与其它脊椎动物IGFBPs结构类似，都包括富含半胱氨酸、相对保守的氨基端(N端)、羧基端(C端)和不含半胱氨酸、高度变化的中间区域。通过Northern杂交实验，在鲤鱼肝脏中分别只检测到一种IGFBP-1和IGFBP—3的转录本，而IGFBP—2却发现了两种形式的转录本。
与其它脊椎动物IGFBPs氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现，鲤鱼IGFBP-1、—2和—3与近源鱼种有较高的同源性，进化关系较近，与哺乳动物进化关系较远。
2.除了IGFBP-1在垂体表达较弱外，IGFBP-1、—2和—3 mRNA在脑各分区中表达量都较高。IGFBP-1 mRNA在肝脏、胸腺、血液、视网膜和肌肉中表达量都较高，肾脏、心脏、皮肤、鳃丝、脾脏、中肠和精巢表达量次之，在后肠、前肠、卵巢和头肾等其它组织中表达量很低；IGFBP—2 mRNA尽管在肝脏中表达量最高，但在肝脏、垂体、卵巢和精巢中的表达量也较高，在白肌、胸腺和头肾中表达量次之，而在视网膜、心脏和其它组织中只能检测到很微弱的表达条带。IGFBP—3 mRNA在视网膜、红肌、肝脏、心脏、后肠、脾脏和精巢中表达量相对较高，白肌、肾脏、胸腺和卵巢中表达量相对较低，头肾、血液、皮肤、鳃丝、中肠和前肠中表达量更低。在受精卵和胚胎分裂期都没有检测到IGFBP-1、—2和—3 mRNA表达，直到囊胚期才能检测到其mRNA，并随着胚胎发育阶段的进行它们的表达量升高，且在某些阶段表达量急剧增加。结果表明，IGFBP-1、—2和—3可能参与了鱼类的早期发育。
IGFBP-1和—2 mRNA的表达量在卵巢发育期较低，在成熟期急剧增加，随之在退化期恢复到极低的水平。IGFBP—3 mRNA在卵巢发育期的表达显著高于成熟期和退化期。在精巢中，IGFBP-1 mRNA在发育期和成熟期的表达要显著高于退化期；IGFBP—2的表达以成熟期为最高；IGFBP—3 mRNA在三个时期的表达量没有显著性变化。这些结果表明，IGFBP-1、—2和—3基因可能参与了鲤鱼性腺的发育。
3.低浓度的GH(1nM)就可以使肝细胞中IGFBP-1 mRNA表达量显著下降，并且随着GH浓度的增加，抑制程度没有显著性变化。与IGFBP-1不同，GH抑制IGFBP—2 mRNA的表达呈现剂量依存效应。10nM GH能使IGFBP-1 mRNA的表达量先下降，12小时达到最低，随后表达量逐渐增加直至恢复原有水平。不同的是，IGFBP—2 mRNA的表达水平呈现时间梯度效应。进一步对下游信号通路研究表明，MAPK和PI3k信号转导途径可能都参与了GH对二者在鲤鱼肝细胞中的表达调控。
0.1μM insulin能显著性增加IGFBP-1和—2 mRNA的表达量，但在1μM和5μM的高浓度下，表达量与对照组相比差异不显著。不同浓度的8-CPT—cAMP、Forskolin和IBMX都能刺激鲤鱼肝细胞中IGFBP-1 mRNA表达，且量剂量依存方式。腺苷酸环化酶抑制剂MDL12330A和PKA的选择性抑制剂H—89都能够阻断insulin对IGFBP-1 mRNA的刺激表达。这表明，至少PKA信号途径参与了insulin刺激肝细胞中IGFBP-1的基因表达调控之中。
4.克隆得到了鲤鱼IGFBP-1、—2和—3基因的启动子序列，长度分别是1412bp、1286bp和1187bp。在鲤鱼IGFBP-1和IGFBP—3启动子中，距离潜在转录起始位点26bp和22bp处各存在一个TATA框，TATA框上游只在IGFBP-1启动子中发现CAAT框，而在IGFBP—3中则没有，取而代之则是一个SP1结合位点。在IGFBP—2启动子中，不存在TATA框和CAAT框，只发现一个SP1结合位点和富含G/C的基簇。另外，三者都存在CREB、HNF、Pit-1、Oct-1、RXR、GR、ER、PR和SRY等转录因子结合位点。同时只在IGFBP-1的启动子上发现了厌氧诱导因子结合位点。结果表明，它们的启动子都存在基础和激素应答表达，但三者的表达调控机制又不完全相同。