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CCDC152(Coiled-coil Domain Containing Protein 152)是 CCDC 家族的一个成员,含有四个卷曲螺旋结构,在哺乳动物中高度保守,功能未知。生物信息学结构预测发现CCDC152与酵母中的GCN4结构相似。GCN4在酵母中以同源二聚体的形式起转录调节作用,在氨基酸缺乏时能启动多种氨基酸合成酶的表达。组蛋白修饰的最根本作用是染色质的重塑。组蛋白的乙酰化能够对染色质的结构产生影响,参与特定位点基因的活化转录调控,并且在细胞的生长以及分化过程中起十分关键的作用。G蛋白偶联受体(GPCR)是人体最大的信号传导蛋白超家族,介导了神经递质、激素、光、气味分子等小分子物质的生物活性,在细胞信号传递过程中发挥重要的作用。人类重大疾病的发生往往都与GPCR功能紊乱有关,GPCR也是人体内重要的药物靶标。本课题以生物信息学结构分析为指导,结合GCN4的功能特征及转录组测序的结果,研究了 CCDC152和GPCR信号系统之间的关系,探索了 CCDC152的功能以及与组蛋白重塑的关系;主要的研究方法与结果如下:1影响CCDC152表达的因子1.1葡萄糖以及氨基酸缺乏诱导CCDC152表达的变化(1)高浓度葡萄糖对CCDC152表达的影响。用1.5g/L和2.25g/L的葡萄糖对293T和HepG2细胞进行不同时间处理,WB检测CCDC152蛋白的变化。结果显示:1.5g/L和2.25g/L葡萄糖诱导293T细胞,CCDC152表达显著减少;1.5g/L葡萄糖诱导HepG2细胞CCDC152表达显著增加。(2)氨基酸缺乏对CCDC152表达的影响。用EBS(氨基酸缺乏)处理293T和HT22细胞,WB检测CCDC152蛋白的表达变化。结果显示:氨基酸缺乏诱导293T细胞1h,CCDC152表达显著增加;HT22细胞1、2、6h,CCDC152表达显著增加。1.2不同的GPCR激动剂,褪黑激素(M[ela)、促性腺激素释放激素(GnRH)、2,5-二甲氧基-4-碘安非他明(DOI)以及溶血磷脂酸(LPA)对CCDC152表达的调节(1)293T中,WB以及荧光素酶基因检测法检测Mela对CCDC152表达的影响。结果显示:293T细胞中,长时间的Mela处理会导致CCDC152表达显著降低。并且Mela可以通过Gai通路来影响细胞内CCDC152的表达变化。(2)WB检测GnRH对Panc-1和Ovcar-3细胞CCDC152表达的影响。结果显示:GnRH通过激活Gai和Gaq通路影响Panc-1和Ovcar-3细胞CCDC152的表达。(3)WB检测GnRH和DOI对HT22细胞CCDC152表达的影响;GnRH和DOI通过激活Gaq通路影响HT22细胞中的CCDC152的表达。(4)293T中,WB以及荧光素酶基因检测法检测LPA对CCDC152表达的影响。结果显示:1uMLPA处理293T细胞2h会使CCDC152表达显著增加,0.1uM LPA处理1h也会使CCDC152表达显著增加。(5)F-actin染色检测LPA对293T细胞骨架的影响。结果显示:LPA处理293T细胞,细胞形态收缩,应力纤维增多,CCDC152过表达的细胞板状伪足明显增多。1.3CCDC152启动子的研究(1)研究CCDC152在不同细胞中的定位:CCDC152-Red转染HepG2和293T细胞,观察其在细胞内的位置;WB检测293T和Panc-1细胞浆蛋白和核蛋白中CCDC152的含量。结果显示:HepG2和293T细胞中,CCDC152-Red定位在细胞核。293T和Panc-1细胞核蛋白中的CCDC152的含量明显多于浆蛋白中的含量。(2)用荧光素酶报告基因法检测CCDC152结合的启动子的序列、Ca2+和Mela对CCDC152启动子表达的影响。结果显示:293T细胞中,CCDC152趋于结合AP-1、GCN4 以及 CRE 序列 ATGACTCAT;10mM Mela 处理 293T 细胞 30min,CCDC152表达显著降低,2mM Ca2+处理293T细胞5min,CCDC152启动子表达显著升高。2 CCDC152对GPCR及下游关键基因表达的影响WB检测CCDC152过表达的对GPCR及下游关键基因表达的影响。结果显示:CTGF、EGR1、DKK1、TEAD1以及VCL的表达均减少。3 CCDC152影响基因表达的可能机制——组蛋白的修饰WB以及荧光观察鉴定HepG2稳定筛选的细胞系;WB和考马斯亮蓝染色检测CCDC152的表达与组蛋白H3S10p和H3K14ac修饰的关系。结果显示:HepG2细胞中,CCDC152表达变化和组蛋白H3K14的乙酰化呈正相关,与组蛋白H3S10的磷酸化的变化呈负相关。综上所述:CCDC152主要定位在细胞核,能对环境中的葡萄糖以及氨基酸的缺乏做出应答;GPCR激动剂Mela、GnRH、DOI以及LPA可能通过不同的G蛋白通路调节CCDC152的表达;CCDC152通过影响组蛋白的修饰,影响GPCR及下游关键基因的表达。