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研究背景肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病,发病率呈逐年上升,一直是生物学和医学界研究的重心和难题。近年来,肿瘤分子靶向药物已为临床肿瘤治疗提供了新的有效途径。同时,寻找新的肿瘤治疗靶点也成为肿瘤研究领域的重点和热点。Cofilin蛋白是肌动蛋白解聚因子家族成员之一,具有调控细胞骨架动态变化、有丝分裂、细胞外基质粘附以及细胞伪足形成等多方面的功能,参与了肿瘤的发生和发展、在肿瘤细胞的侵袭和转移、增殖和凋亡过程中发挥了重要的作用。Cofilin蛋白在肿瘤组织中的表达和激活状态与肿瘤恶性程度密切相关,有望成为一个预测肿瘤转移和预后的临床靶标,开发以Cofilin为治疗靶点的新型药物,将有望为临床肿瘤治疗提供新的途径。近年来,对Cofilin蛋白的结构功能和生物学效应研究都取得了很大的进步,但对其调控肿瘤细胞凋亡的具体分子机制尚不明确。课题组前期研究发现,十字花科蔬菜中活性成分异硫氰酸丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC)和4-甲硫基丁基异硫氰酸酯(4-methylthiobutyl isothiocyanate,Erucin)可分别诱导多种白血病细胞和乳腺癌细胞发生线粒体途径细胞凋亡,并且观察到明显的Cofilin蛋白线粒体转位,呈现良好的时效量效关系。并在Erucin诱导的乳腺癌细胞凋亡过程中发现明显的线粒体分裂增加,提示Cofilin线粒体转位介导的细胞凋亡可能与线粒体分裂相关。同时,线粒体分裂和细胞自噬密切相关,已有报道,线粒体分裂可诱导线粒体自噬的发生,而肌动蛋白(Actin)在自噬的形成过程中发挥了极其重要的作用,基于Cofilin具有调控Actin解聚和聚合的基本功能以及其可能在线粒体分裂中的调控作用,提示Cofilin可能参与了线粒体自噬的调控。因此,本课题主要采用了多种影响Cofilin线粒体转位的药物,深入研究了Cofilin调控肿瘤细胞凋亡、线粒体损伤、线粒体分裂和线粒体自噬的分子机制,并明确了干预Cofilin线粒体转位的药物的抗肿瘤效应。1.1 AITC体内外水平诱导人白血病细胞线粒体损伤和细胞凋亡伴随着Cofilin的去磷酸化激活采用AITC处理白血病细胞和白血病患者外周血单个核细胞,流式细胞术和Western blot检测发现AITC可梯度浓度和时间诱导白血病细胞发生凋亡和线粒体膜电位下调,凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3和PARP降解激活,伴随着线粒体损伤标志分子细胞色素C的释放,同时引起Cofilin蛋白去磷酸化激活。并在U937裸鼠异种移植瘤模型体内水平验证了AITC的抗白血病作用良好,同时伴随着Cofilin的去磷酸化激活。1.2 AITC诱导Actin解聚以及G-actin和Cofilin线粒体共转位Western blot和激光共聚焦检测发现AITC可梯度时间诱导丝状肌动蛋白(F-actin)解聚成球状肌动蛋白(G-actin),并同时伴随着Cofilin和Actin线粒体转位,激光共聚焦研究发现Cofilin仅与G-actin在线粒体发生共定位,而与F-actin几乎无共定位。提示AITC可能通过诱导Cofilin和G-actin转位到线粒体,并在线粒体发生相互作用,最终导致线粒体损伤和细胞凋亡。1.3 Cofilin调控的线粒体途径细胞凋亡依赖于ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路的激活采用PP1/PP2A磷酸酶抑制剂Calyculin、PI3K抑制剂LY294002、ROCK1抑制剂Y-27632研究发现ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路是调控Cofilin介导的线粒体途径细胞凋亡的关键上游通路。2.Cofilin调控线粒体分裂的分子机制研究2.1 Erucin诱导乳腺癌细胞线粒体损伤和凋亡伴随着线粒体分裂Erucin可诱导乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞线粒体膜电位下调,细胞凋亡增加,并同时伴随着细胞色素C的释放,激光共聚焦和电镜均观察到线粒体分裂增加。2.2 Erucin诱导的乳腺癌细胞线粒体分裂和凋亡依赖于Cofilin和Drp1的线粒体转位Erucin可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞Cofilin和Drp1的线粒体转位增加。蛋白酶K消化掉线粒体外膜研究表明Cofilin和Drp1转位后定位于线粒体外膜,免疫沉淀和激光共聚焦研究发现Cofilin和Drp1在线粒体外膜呈现直接结合的共定位。分别基因敲降Cofilin和Drp1均能显著降低线粒体外膜Cofilin和Drp1的直接结合和共定位,同时可阻断Erucin诱导的线粒体分裂和细胞凋亡。2.3 ROCK1调控了Cofilin和Drp1去磷酸化激活和线粒体转位分别构建Cofilin丝氨酸3(Ser 3)位点和Drp1丝氨酸637(Ser 637)位点的磷酸化和去磷酸化突变质粒研究发现Cofilin和Drp1线粒体转位主要依赖于Cofilin Ser3位点和Drp1 Ser637位点去磷酸化激活。基因敲降ROCK1或采用其抑制剂Y-27632均能研究内容和结果1.Cofilin调控线粒体损伤和细胞凋亡的分子机制研究阻断Erucin诱导的Cofilin和Drp1的去磷酸化激活,线粒体分裂和细胞凋亡。2.4裸鼠体内实验验证了Cofilin和Drp1介导的线粒体分裂在Erucin抗乳腺癌移植瘤中的重要作用3 Cofilin调控线粒体自噬的分子机制研究3.1 PINK1/Park2介导的线粒体自噬伴随着Cofilin的线粒体转位和线粒体分裂采用多种线粒体分裂诱导剂(STS、ETO、CCCP)处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,激光共聚焦和电镜观察到Cofilin的线粒体转位、线粒体分裂和线粒体自噬增加,Western blot检测到Cofilin蛋白的线粒体转位以及PINK1/Park2线粒体自噬通路的激活。3.2线粒体自噬的发生依赖于Cofilin的线粒体转位基因敲降Cofilin可显著阻断STS、ETO、CCCP诱导的线粒体分裂和PINK1/Park2通路的激活,减少线粒体自噬的发生,而过表达Cofilin则可显著增加线粒体分裂和线粒体自噬的发生。3.3 Cofilin通过影响线粒体膜电位调控线粒体自噬敲降Cofilin可显著阻断STS、ETO、CCCP诱导的线粒体膜电位下调,阻断药物诱导的PINK1切割蛋白酶(MPPβ/PARL/AFG3L2)表达下调;而Cofilin过表达则与敲降结果相反,提示Cofilin可能通过调控线粒体膜电位从而调控PINK1蛋白的活化及线粒体自噬的发生。3.4 Cofilin通过调控线粒体分裂位点的Actin转换调控线粒体分裂和线粒体自噬多种线粒体分裂诱导药物均能诱导Cofilin和G-Actin发生线粒体转位,并在线粒体外膜上发生共定位;Actin聚合抑制剂(Latrunculin B)、解聚抑制剂(Jasplakinolide)均能阻断药物诱导的线粒体分裂和线粒体自噬;激光共聚焦发现Cofilin在线粒体分裂位点介导的F-actin/G-actin转换在调控线粒体分裂和线粒体自噬过程中发挥了重要的作用。结论本课题主要采用了多种影响Cofilin线粒体转位的药物,深入研究了Cofilin调控线粒体途径细胞凋亡和线粒体自噬分子机制,取得的主要结论如下:1.异硫氰酸丙酯(AITC)可诱导白血病细胞凋亡,主要通过诱导ROCK1/PTEN/PI3K/PPs通路的激活,引起Cofilin去磷酸化激活,激活的Cofilin会与G-actin转位到线粒体,在线粒体发生相互作用,调控线粒体损伤,导致细胞色素C释放和细胞凋亡。2.4-甲硫基丁基异硫氰酸酯(Erucin)可诱导Cofilin和线粒体分裂关键分子Drp1第三军医大学博士学位论文发生线粒体转位,两者在线粒体外膜发生直接的相互作用,调控线粒体分裂,从而导致乳腺癌细胞线粒体损伤,细胞色素C释放和细胞凋亡。3.采用多种线粒体分裂诱导剂(STS、ETO、CCCP)研究Cofilin调控的线粒体自噬机制发现,Cofilin是通过调控线粒体外膜分裂位点的Actin转换而参与调控了线粒体分裂,进而引起线粒体膜电位下调,导致PINK1/Park2途径激活和线粒体自噬的发生。