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毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白高水平表达、具有近似于哺乳动物细胞翻译后的修饰与加工功能和安全性好等特点，与传统酿酒酵母相比，又具有高表达与遗传稳定等特点，越来越有取代传统酿酒酵母而作为药用蛋白生产系统的趋势。但毕赤酵母在我国研究起步晚，迄今为止未见有用于临床药物生产的报道。 本研究首先以经密码子改造的红色荧光蛋白(DsRFP)为模式蛋白，在本实验室建立毕赤酵母表达系统。对影响毕赤酵母电转化的因素进行研究后发现质粒线性化程度、DNA浓度以及电转化参数对转化效率具有重要影响，对这些条件进行优化后转化效率达到105cfu/μg DNA。通过比较超声波、酶解法、玻璃珠法、反复冻融以及高压匀浆等多种细胞破碎方法，发现高压匀浆破碎效果最好，细胞破碎率达95％。重组质粒线性化后，电转化酵母，采用G418-RDB相结合的双重筛选方法筛选阳性克隆，消除了传统RDB法筛选假阳性的出现，缩短了筛选时间。改进的总DNA PCR扩增方法不但可以鉴定重组质粒是否插入宿主菌基因组，而且可以一步确定表型，其结果与甲醇基本培养基（MM）/葡萄糖基本培养基(MD)平板鉴定的表型一致，都为His+Mut+表型。诱导表达48hrs后，通过可见光、荧光显微镜观察以及SDS-PAGE鉴定，证实DsRFP在重组酵母中获得了高效表达，占细胞总蛋白的11％，摇瓶发酵蛋白产量达到1.2g/L。基因剂量与外源蛋白表达量正相关，10拷贝外源重组菌株表达量是3-4拷贝的2.4倍。用硫酸铵分级沉淀、DEAE-5PW阴离子交换层析和S-HyperD阳离子交换层析对重组DsRFP(rDsRFP)进行了纯化，发现rDsRFP在溶液中以四聚体形式存在，与天然状态一致，提示毕赤酵母不但高效表达了rDsRFP，而且其表达的rDsRFP具有正确构象。这些结果表明笔者初步已经在本实验室成功建立了中试规模的毕赤酵母表达系统。 天然乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)以颗粒形式存在，能诱生保护性抗体，是乙型肝炎疫苗的主要成分。本研究按毕赤酵母偏嗜密码子在PROTEINsolve软件上优化HBsAg基因序列，进行全基因合成，然后将优化前、后的基因分别构建酵母胞内表达质粒。转化酵母后，用G418-RDB平板法、总DNA PCR法以及MM/MD筛选获得表型为His+Mut+的重组菌株。诱导表达后，用定量ELISA进行表达检测。结果发现，优化后基因重组HBsAg(rHBsAg)表达量是优化前基因表达量的10倍。基因序列分析结果显示，优化前HBsAg基因5个Arg密码子中有4个使用频率接近零，近60％的密码子在毕赤酵母中使用频率低，而且存在稀有密码子串连现象。说明密码子严重影响rHBsAg在酵母中表达水平。基因拷贝数与表达量实验显示基因剂量对rHBsAg的表达水平没有影响。对rHBsAg摇瓶发酵条件进行了优化。诱导60hrs后rHBsAg表达量达到5.6mg/L，OD600为58。发酵罐高密度发酵后目的蛋白的产量比摇瓶发酵提高4.7倍。用硫酸铵分级沉淀、疏水层析与CsCl等密度超速离心进行了纯化。SDS-PAGE电泳结果说明，rHBsAg分子量大约为23kD，没有糖基化。超离发现在密度为1.19mg/mL处含量最大，说明毕赤酵母表达的HBsAg自组装为颗粒，电镜观察超离纯化后的rHBsAg为均一22nm颗粒，抗原竞争ELISA显示rHBsAg具有较强的活性。至此本研究建立了毕赤酵母表达HBsAg的规模生产工艺。 严重呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV nucleocapsid)蛋白（N蛋白）在病毒的复制与包装机制以及病理过程中具有重要的作用，对患者的血清学研究发现抗N蛋白体液免疫应答是机体对SARS病毒感染的最主要免疫应答之一，因而有可能为血清学诊断的候选抗原。用PCR蛋白全长cDNA，构建pPIC3.5K-SCoVN酵母表达质粒。质粒线性化后电转化毕赤酵母，用G418-RDB平板法、总DNA PCR法以及MM/MD筛选获得表型为His+Mut+的重组菌株，用SDS-PAGE法与Western-blot分析表明，重组N蛋白可在毕赤酵母中获得高效表达。对N蛋白摇瓶表达条件进行优化。诱导2d后N蛋白表达量达到约450mg/L，OD600为56，N蛋白表达量占细胞总蛋白的8％;高密度发酵后产量达到2.5g/L，是摇瓶发酵的5.5倍，生物量达到348OD600。Western-blot分析表明重组N蛋白对鼠源单抗以及SARS病人阳性血清具有较强的特异性反应。本研究首次在毕赤酵母中表达出高活性的N蛋白，并建立了规模生产工艺，为研究N蛋白在SARS病毒的包装机制、制病机理以及研制SARS的血清诊断试剂打下基础。