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【背景与目的】慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是一种进行性的慢性炎症疾病,胰腺外分泌实质常常被破坏,并由纤维组织所取代,主要表现为餐后腹痛,痛点常常位于上腹部,可向背部放射,恶心和呕吐是常见的伴随症状。腹痛是CP中最显著的症状和主要的临床挑战,是高达90%的患者住院的主要原因,也是临床医师治疗CP时面对的巨大难题。尽管人们对CP导致腹痛的研究经历了一个从胰腺解剖学机制到神经生物学机制的转变,但尚未完全揭示CP时内脏痛觉信息的上传途径及其在高级中枢部位的调控机制。胰腺感觉传入纤维一部分经双侧T4~L4节段的脊神经上传,一般进入脊髓背角换元以后,经由脊髓丘脑束将感觉信息向上传入高级中枢,如岛叶和躯体感觉中枢,这一传入途径已被人们所熟知;另一部分传入纤维经双侧迷走神经上传,投射入脑干孤束核(nucleus tractus solitarii,NTS),NTS投射纤维向上多经臂旁核传递到与情感有关的边缘系统和高级认知中心。NTS作为重要的内脏感觉上传的中继核,与痛相关皮层之间如何联系及其功能调节,目前尚无足够证据。近年来对前扣带回(anterior cingular cortex,ACC)在认知、情绪和疼痛等方面受到越来越多的关注。有研究在CP疼痛患者和动物模型的脑电图和功能磁共振中观察到ACC的结构和功能发生重组现象,此外CP疼痛患者切除胰腺后仍残留疼痛,提示ACC的中枢敏化在CP引起的内脏痛的维持中起着关键的作用。然而CP疼痛信息经NTS如何上传至ACC,它们是否存在直接或间接的纤维联系,ACC如何参与调节CP内脏痛敏的机制,这些仍然不清。因此,本研究旨在建立三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱发的CP大鼠内脏疼痛模型,利用神经束路追踪法、形态学、分子生物学、电生理学和行为学等方法,观察NTS向ACC的直接上行投射,检测ACC内的锥体神经元及其突触传递和谷氨酸受体在CP内脏疼痛状态下形态与功能发生的可塑性改变;同时结合药理学、光遗传学与化学遗传学等方法进行干预,探讨ACC在CP内脏痛敏的发生机制中的作用。【方法】(1)经SD大鼠的胰胆管注射三硝基苯磺酸(TNBS)建立CP模型;利用HE染色观察胰腺的病理变化;(2)应用von Frey纤维丝、旷场实验、高架十字迷宫实验、大鼠转棒疲劳仪实验和强迫游泳实验,进行大鼠行为学观察,测定行为学变化的时相性;(3)将顺标示踪病毒rAAV-CaMKIIα-EYFR-WPRE-pA注入NTS,观察NTS向高级中枢的上行投射纤维联系;免疫组织化学染色检测CP术后NTS与ACC内痛相关核蛋白FOS的表达;(4)应用Med64多位点场电位方法诱发和记录ACC内多位点动作电位的长时程增强(LTP)现象及其变化;应用全细胞膜片钳技术记录ACC V层锥体神经元诱发的自发性兴奋性突触后电流(Spontaneous excitatory post synaptic currents,s EPSCs)和双脉冲比值(paired pulse ratio,PPR);(5)利用免疫组化荧光双重标染色和Western blot方法分别观察CP术后2周ACC内囊泡膜谷氨酸转运体1(Vesicular glutamate transporter 1,VGluT1)的表达;运用Western blot方法分别检测膜蛋白与浆蛋白中谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型NR2B及磷酸化水平和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体亚型GluR1的表达及磷酸化水平的变化;免疫电镜技术观察GluR1的分布及其与突触后活性区的距离关系;(6)使用海人藻酸(Kainic acid,KA)损毁大鼠双侧ACC,检测机械性刺激引起的内脏痛反应及其变化;利用药理学实验,在双侧ACC置管,1周后建立CP模型,3周后双侧微量注射NMDA受体拮抗剂DL-2-氨基-磷酸戊酸(DL-AP5)和AMPA受体拮抗剂6-氰基-7-硝基-喹喔啉-2,3-二酮(CNQX),1h后检测机械性刺激引起的内脏痛行为及其改变;(7)利用光遗传学方法,将rAAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry病毒注入CP组与sham组大鼠双侧ACC,1周后在ACC上方置光纤并建立CP模型,3周后在蓝光照射下观察机械性刺激引起的内脏痛反应和对旷场实验进行观察,检测CP模型动物行为表现的改变;(8)利用化学遗传学方法,将病毒rAAV-CaMKIIα-hM4Di-mCherry注入CP组与sham组大鼠双侧ACC,3周后腹腔给予CNO,1h后观察机械性刺激引起的内脏痛反应和对旷场实验进行观察,检测CP模型动物行为表现及其变化。【结果】(1)大鼠CP模型的制作及胰腺的形态学变化TNBS诱发的CP模型大鼠与sham大鼠相比体重增加缓慢,胰腺出现小叶腺泡数减少、萎缩,小叶间纤维间隔变厚、并伴有水肿,及淋巴细胞浸润等病理改变。(2)CP大鼠的内脏痛行为学表现和对其高级脑功能活动的影响在术后7~28d,CP大鼠缩腹反应阈值(abdominal withdraw threshold,AWT)下降;旷场实验中总活动路程与中央活动路程百分比均降低;高架十字迷宫实验结果显示CP大鼠总穿梭次数与开臂滞留时间百分比均显著下降;在强迫游泳实验中,CP大鼠不动时间延长;转棒实验结果显示,与对照组相比掉落潜伏期没有显著性差异。(3)NTS向ACC发出直接上行投射及其参与CP内脏痛信息传递的形态学证明将病毒注射入NTS内3-4周后直接灌注切片,结果显示在ACC内可以见到病毒顺标的纤维和终末;在制成CP模型的不同时间点,CP大鼠的NTS和ACC内均可见到表达FOS蛋白的神经元;随着CP模型动物存活时程的延长,FOS阳性神经元的数量显著增多,且ACC的II-III层与V-VI层之间的FOS阳性神经元数量具有显著性差异;NTS和ACC内FOS神经元的数量变化具有一致性,两者之间呈正相关关系。(4)CP内脏痛敏大鼠ACC内锥体神经元突触传递的可塑性变化Med64多通道场电位记录结果显示CP大鼠ACC内锥体神经元的放电幅值明显减少,且产生LTP的通道数量和分布均减少。全细胞膜片钳记录CP大鼠ACC内V层锥体神经元,其s EPSCs的频率和幅值增加,且CP大鼠ACC内锥体神经元的PPF幅值减少;电刺激诱发的AMPA受体和NMDA受体介导的兴奋性突触后电流增强;在电流钳模式下观察到了CP大鼠ACC锥体神经元放电数目增加,引起动作电位的最小电流减少。(5)CP内脏痛敏大鼠ACC内谷氨酸含量及其受体表达和分布的可塑性变化免疫组化和Western blot结果证实CP大鼠ACC内VGlu T1表达上调;Western blot检测分离膜蛋白和浆蛋白的结果表明CP大鼠膜蛋白内GluR1、pGluR1、NR2B和p NR2B上调,而浆蛋白内GluR1、pGluR1和p NR2B表达不变,NR2B减少。免疫电镜结果表明大鼠ACC内的GluR1阳性标记颗粒主要位于突触后;CP大鼠ACC内可见GluR1阳性标记颗粒至突触后膜的距离减少,提示它们有向突触活性区移的倾向。(6)CP内脏痛敏大鼠双侧ACC损毁或给予谷氨酸受体拮抗剂对动物内脏痛行为和高级脑功能的影响双侧损毁ACC可以显著的提高CP大鼠的缩腹反应阈值,旷场实验中损毁ACC的CP大鼠与对照CP大鼠相比,总活动路程和中央活动路程百分比显著升高;双侧ACC给予AMAP受体拮抗剂DL-AP5和NMDA受体的拮抗剂CNQX,均可以显著升高CP大鼠的缩腹反应阈值,在旷场中,中央活动路程百分比显著升高。(7)用光遗传学和化学遗传学方法分别激活和抑制CP内脏痛敏大鼠ACC内锥体神经元的活动对动物内脏痛行为和高级脑功能的影响光遗传学实验结果表明,蓝光刺激激活ACC内锥体神经元不会影响CP大鼠的缩腹反应阈值,在旷场实验中,CP大鼠的总活动路程和中央活动路程百分比在刺激中与刺激前后对比也没有统计学差异;化学遗传学实验表明,腹腔给予CNO抑制ACC内锥体神经元,可以提高CP大鼠的缩腹反应阈值和在旷场中运动减少的情况,但对正常大鼠无影响。【结论】(1)NTS至ACC存在直接的上行投射纤维联系;TNBS胰胆管内注射诱发CP引起的内脏痛行为改变;NTS与ACC神经元内FOS表达量增加,且有时相性;CP内脏痛大鼠运动减少与焦虑抑郁样负性情绪有关;(2)CP内脏痛状态下,ACC内兴奋性突触传递增强,发生可塑性改变,其发生与谷氨酸的释放及其受体表达变化有关;(3)在CP内脏痛状态下,兴奋ACC内锥体神经元不能加重CP大鼠的内脏痛与负性情绪;而抑制ACC内锥体神经元兴奋性可以有效缓解CP大鼠的内脏痛和负性情绪。上述结果提示ACC可能是CP引起内脏痛的一个潜在治疗靶点。