论文部分内容阅读
目的：研究PGC-1α和HIF-1在神经血管单元主要组成细胞的缺氧预处理中所起到的作用及可能涉及的机制。缺血性脑卒中是严重危害人类健康的疾病之一，然而，其有效的治疗方法是相当局限的。缺氧预处理现象为深入研究缺血性脑卒中的病理生理机制提供了良好的实验基础，而对于其核心内容——细胞内在保护体系的探讨更有可能为缺血性脑卒中的治疗药物开发带来希望。
方法：本研究采用大鼠动脉内皮细胞(SUVRAEC)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)作为研究的载体，以缺氧作为预处理刺激，氧气葡萄糖剥夺(OGD)-再灌注作为缺血性脑卒中的体外模拟方法。两种细胞株各自分为空白对照组、单纯缺氧组、单纯OGD-再灌注组、缺氧预处理+OGD-再灌注组。将由MTT、DAPI染色法等检测的细胞活性、细胞死亡率以及Caspase-3表达所显示的细胞凋亡情况作为缺氧预处理保护性的客观指标，并采用WesternBlot方法检测HIF-1和PGC-1α，及其共同的下游因子VEGF的蛋白含量，以明确这些保护性因子在缺氧预处理中的表达规律。同时，把使用Oxyblot和MitoSOX染色分别检测的细胞内和线粒体内ROS水平作为下游观察指标之一。除此以外，RNA干扰技术被用于HIF-1和PGC-1α的恒定基因敲除，从而为两者在缺氧预处理中起到的作用提供更为充分的证据。
结果：在PC12和动脉内皮细胞中均能成功建立缺氧预处理模型，其中缺氧预处理的刺激强度均为30分钟，氧气葡萄糖剥夺2小时(PC12细胞)或10小时(内皮细胞)及其后的再灌注24小时作为损伤刺激，预处理刺激与损伤刺激的时间间隔均为48小时。动脉内皮细胞与PC12在缺氧诱导下的细胞适应性反应在时程和强度上基本相同，表现为约15％的细胞活性得以保存、保护性因子不同程度的上调及过氧化水平的显著降低。HIF-1，PGC-1α和VEGF时间依赖的表达规律与缺氧预处理诱导的细胞保护效应时间窗相符。在HIF-1和PGC-1α基因敲除的细胞株中，缺氧预处理的保护作用明显减弱，表现为减少细胞死亡的效应消失、促进VEGF和/或清除ROS的效应不同程度的下降。其中，以PGC-1α基因敲除后对VEGF和ROS的影响更为明显。最后，在敲除HIF-1和PGC-1α基因的PC12细胞中，VEGF的表达无法由缺氧预处理诱导的其他机制参与代偿；而在敲除PGC-1α基因的内皮细胞中，ROS的清除作用和VEGF的表达均不能由缺氧预处珲诱导代偿。
结论：动脉内皮细胞具有由缺氧预处理所诱导的缺血耐受性，且这一细胞适应性反应的强度与时程与PC12相似。HIF-1和PGC-1α在介导缺氧预处理产生的细胞保护作用中均不可缺少，其中PGC-1α在调控VEGF的表达和ROS清除上的作用较HIF-1更为重要。在动脉内皮细胞中，缺氧预处理的作用主要通过PGC-1α主导的ROS清除和VEGF的增加而产生；而在PC12细胞中，相应的作用主要通过HIF-1和PGC-1α主导的VEGF上调而实现。