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近年来,抗真菌药物的大量滥用导致了真菌的耐药现象越来越严重,各类真菌普遍存在耐药性己经成为临床抗真菌治疗失败的主要原因。其中,耐药白色念珠菌引起的感染直接威胁感染者的生命。传统的细胞生物学方法包括酶联免疫组化,分子生物学,药敏试验等,需要复杂的样品前处理,存在耗时长,成本高等缺点,无法快速准确地对耐药白念珠菌进行早期诊断,从而耽误了治疗。拉曼光谱,尤其是表面增强拉曼光谱技术,具备快速、实时、无损的特点,在很多领域应用广泛。同时,不受水分干扰、荧光淬灭、特征性强等优势使其非常适合用于生物体系的研究。因此,我们尝试将表面增强拉曼光谱应用于耐药真菌的诊断以及抗菌药物的筛选。本文将针对以下三个方面开展研究,以期进一步完善表面增强拉曼光谱法及其应用,并为真菌诊断和药物筛选提供新策略和新方法。1.动态表面增强拉曼光谱法的建立及参数考察表面增强拉曼光谱法(SERS)是一种快速、实时、无损的检测方法,由于其不受水干扰,因此十分适合生物样品的研究。但是目前的细胞检测手段仍存在一些问题。制备适应特定生物细胞的SERS基底需耗费大量的人力物力,普及性较差。而采用制备简单的广泛使用的SERS基底纳米溶胶,则存在灵敏度较低、重现性较差、激光对生物样品造成破坏且检测前等待时间较长的问题。本章针对后者对其进行了改进,即引入动态表面增强拉曼光谱法(D-SERS)。该法无需制备复杂的特异性基底,同时具备高灵敏、高重现性、水作为生物样品的保护溶剂且在检测前无需等待菌胶混合的大量时间等优点,很好解决了传统表面增强拉曼光谱法中存在的问题。本研究制备了3类SERS增强基底,详细表征了各类SERS基底的结构和特征。同时也考察了基底对白念珠菌的活性影响,综合比较基底对细胞的活性影响与增强效果最终优选出最佳的增强基底接下来本章详细介绍了D-SERS的原理,并利用工具菌与优选的SERS基底及对方法学指标包括灵敏度、稳定性及重现性进行了考察,同时也进行了详细的真菌光谱峰归属分析。2.动态表面增强拉曼光谱法用于耐药白色念珠菌的诊断研究常规诊断耐药白色念珠菌的方法为药敏实验。作为金标准方法,该法确实准确性好,但耗时较长通常为24h。这显然无法满足日益增长的真菌感染的诊治需求。如果能够快速准确的诊断出耐药菌,这无疑具有很大的临床意义。本章采用具有快速、指纹图谱特征的D-SERS法用于鉴别耐药白色念珠菌,并同时以相应的敏感菌株作为参照(二者在外观形态几乎无差别)。此外,我们对采集的SERS光谱进行了2种信息处理方法:峰比值法及化学计量学法。峰比值法帮助我们找出了区分两类菌株差异的光谱区域。化学计量学法即PLS-DA建立了敏感和耐药菌株的分类模型,以较高的准确度区分了二者并进行了未知菌株的预测。结果表明两种方法均可达到快速准确的诊断耐药真菌的目的。3.D-SERS法用于不同机理的抗真菌药的分类研究通常用于真菌治疗的药物筛选方法为药敏实验。该方法存在耗时较长的缺点,同样无法满足日益增长的真菌感染的诊疗需求。如果在较短时间内判断出某抗菌药的治疗效果,这必定对临床用药具有很大的意义。本章中利用D-SERS法快速地对不同机理的抗菌药进行了分类,并同时与各类抗菌药的抗菌机理一一对应。我们还利用PLS-DA法建立的模型以及留一法进行了未知药物机理的预测。通过对上述药物的快速筛选,我们发现棘白菌素类药物具有很好的抗菌活性。此外,虽然文献表明纳米银由于无耐药性,具有良好的抗菌活性,但也会随着各种因素的变化发生抗菌效果的改变。如果纳米银与菌细胞表面电荷存在静电排斥,这将降低纳米银的抗菌效率。制备与菌细胞相反电荷的纳米溶胶比较复杂,而急性毒性的纳米银虽然可以克服电荷壁垒起到较好的抗菌效果,但过多的释放也会对人体造成相应的细胞损伤。因此,如果将亚急性毒性的纳米银和高选择性的棘白菌素类抗真菌药联合使用,必将起到良好的抗菌效果。本章中将棘白菌素类药物和亚急性毒性纳米银与白色念珠菌共孵育,同时以联合用药后的D-SERS光谱的变化对该过程进行监测。研究发现高浓度的棘白菌素类药物联合亚急性毒性纳米银能够达到与单独急性纳米银相当的抗菌效果。