论文部分内容阅读
目的已有计算机程序的分析预测结果显示汉坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白,而且属于Ⅱ类融合蛋白,而内在的结构区(aa763～785)很可能是介导膜融合的关键部位——融合肽。另外,已有实验证据支持汉坦病毒的融合肽位于糖蛋白G2而不是G1上。鉴于汉坦病毒GM04-38株也存在上述保守区(aa763～785),本研究拟通过实验对此保守区是否为其融合肽做出初步判断。从而为阐明HV的细胞融合机制、研制有效的汉坦病毒新型疫苗和治疗制剂奠定基础。方法根据GM04-38株M片段cDNA基因序列应用Primer 5软件设计引物,同源重组PCR法构建10个单个氨基酸突变的糖蛋白G2的克隆载体。PCR扩增糖蛋白突变体的G2编码区基因,双酶切后与经过同样双酶切的表达载体pCAGGS/MCS连接,转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选糖蛋白G2单个氨基酸突变体的表达载体。经双酶切和测序证实。然后将野毒株G1Bgl与GmG2/某糖蛋白G2突变体表达载体共转染Vero E6细胞,间接免疫荧光检测蛋白表达情况,并经酸性MEM处理、Giemsa染色后观察细胞融合现象的发生。结果1.构建了10个糖蛋白G2单个氨基酸突变的克隆载体C765A、P767D、P768D、C770A、P771D、G772D、G774D、G776D、C777A、C780A,双酶切鉴定目的片段和载体分别为1.6kb和2.7kb,并经测序证实。2.构建了10个糖蛋白G2单个氨基酸突变的表达载体GmG2-C765A、GmG2-P767D、GmG2-P768D、GmG2-C770A、GmG2-P771D、GmG2-G772D、GmG2-G774D、GmG2-G776D、GmG2-C777A、GmG2-C780A,双酶切鉴定目的片段和载体分别为1.6kb和4.7kb,并经测序证实。3.间接免疫荧光实验显示野毒株G1Bgl与GmG2共转染组、G1Bgl与某糖蛋白G2突变体表达载体共转染组均有亮绿色荧光信号产生,呈胞浆分布。4.野毒株G1Bgl与GmG2共转染后在偏酸性条件下可引起Vero E6细胞发生融合,而共转染G1Bgl与某糖蛋白G2突变体表达载体的细胞则没有融合现象发生。结论汉坦病毒GM04-38株G2糖蛋白上潜在融合肽区域(aa763～785)的10个特定的氨基酸突变均可以完全阻断细胞融合的出现而不影响糖蛋白的表达。这强烈提示此保守区与膜融合密切相关,很可能是病毒的融合肽。