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论文首先以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)为研究对象,对其生物合成组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)的发酵条件和发酵动力学进行了研究,并对里氏木霉重组t-PA的分离纯化及其性质进行了探索;然后进行了t-PA突变体的研究,获得了t-PA突变体r-PA基因,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中进行了表达。 采用稀释平板分离法对基因工程菌株Trichoderma reesei进行了分离纯化,对平板上生长良好的单菌落进行摇瓶液态发酵,以t-PA的酶活力为指标,挑选高产菌株,选得的Trichoderma reesei(8)号菌株t-PA产量最高,且遗传稳定性良好。 对Trichoderma reesei(8)生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的代谢调节机制进行了研究。在基础发酵条件下,L-山梨糖、D-蔗糖、可溶性纤维素、CMC、麦芽糖、乳糖和棉子糖等单糖及多糖对t-PA生物合成都有诱导作用,其中L-山梨糖的诱导效果最好,加量以1.0%为宜。葡萄糖及其中间代谢产物对t-PA的生物合成产生分解代谢物阻遏作用。纤维二糖在低浓度时可以促进t-PA的生物合成而在高浓度时对t-PA生物合成起反馈阻遏作用。 应用单因素和正交设计试验法,确定了种子培养基的最佳组成和最佳培养条件。应用正交设计试验法和响应面分析试验法优化出摇瓶分批发酵培养基的最佳组成。通过研究不同发酵条件对t-PA生物合成的影响,获得了最佳摇瓶分批发酵培养条件。优化条件与初始条件的摇瓶分批发酵比较试验结果表明,Trichoderma reesei(8)菌株在优化条件下的t-PA产量(3275.26U/mL)比初始条件下(1.14U/mL)显著提高。 对5L发酵罐上的分批发酵过程进行了分析。选择了适宜发酵条件并以5L发酵罐分批发酵试验数据为依据,采用MATLAB工具软件,利用全局收敛的修正的高斯-牛顿法算法,以误差平方和最小为目标,获得发酵动力学方程待估参数,建立了发酵动力学模型。通过拟合分析证明得到的数学模型误差较小,能较好的反映t-PA的分批发酵过程。 对里氏木霉重组t-PA的分离纯化方法进行了研究,建立了里氏木霉重组t-PA的分离提纯工艺。通过超滤、硫酸铵盐析、Butyl Sepharose 4 F F疏水层析、Sephadex G-25凝胶过滤脱盐、Q-Sepharose F F离子交换层析分离等分离步骤,里氏木霉重组t-PA的比活力由347.78U/mg提高到10619.58U/mg,提纯倍数30.54,活力回收率2.63%。通过SDS-PAGE电泳对各步纯化后样品进行分析,经上述各步将里氏木霉重组t-PA分离为电泳纯。 通过SDS-PAGE纤维蛋白自显影证明了Trichoderma reesei(8)的发酵液中