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肿瘤细胞的恶性生长及转移依赖于新生血管的形成，新生血管向肿瘤组织提供营养和氧气并排出废物[1]。肿瘤的血管依赖性观点一经提出，立即受到广泛关注并迅即成为当今肿瘤生物治疗的研究热点。我们实验室近年开展肿瘤血管生成抑制方面的研究，已分离克隆了多种内源性血管生成抑制因子如：Endostatin(内皮抑素)[2-3]、PF4(血小板因子4)、Angiostatin(血管抑素)的K1片段[4]、以及Plasminogen(人纤溶酶原)的K5片段[5]等，并构建和表达了PFK、PFK-K5、PFK-EN、PFK-VE等多种融合蛋白基因(未报道)。为满足动物实验需要并为今后中试生产作准备，我们开展了酵母表达系统的发酵研究。
甲醇毕赤酵母Pichiapastoris表达系统是继酿酒酵母之后的第二代酵母表达系统，既具有原核表达系统操作简单、表达高效、易于调控等特点，还具有真核细胞特有的蛋白质修饰功能，在表达真核生物蛋白质方面具有独特优越性[52]。该系统由便于控制的细胞营养生长和外源蛋白表达二个阶段组成，前一阶段可实现高密度发酵，后一阶段便于优化表达条件。本文利用甲醇毕赤酵母工程菌P.pastorisGS115(pPICZαA-PFK-K5)表达重组融合蛋白PFK-K5，在摇瓶和发酵罐二个水平上分别探索发酵条件和表达条件，并对表达产物初步进行分离纯化工艺研究。
对摇瓶发酵及诱导表达条件如pH值，甲醇浓度，诱导时间和接种密度等参数进行了研究，确定的表达条件为：恒定摇瓶转速270r/min，最适pH6.0，甲醇诱导浓度1.0％(v/v)。发酵及表达96小时后菌体密度OD600达5.0，PFK-K5表达量为97.17mg/L。摇瓶发酵结果为进一步的发酵罐发酵研究提供了重要参考。
在12.8L发酵罐的发酵实验中，研究了菌体生长及诱导表达二个阶段的工艺条件。发现在菌体生长阶段添加组氨酸(0.1％)可提高菌体密度2.5倍(210g/L)，实现高密度发酵；在诱导表达阶段继续添加组氨酸(0.05％)最终可提高重组融合蛋白PFK-K5的表达3倍(275.2μg/ml)。同时，通过研究发酵过程中溶解氧、菌体湿重、甘油/甲醇浓度及其补料方式与蛋白表达浓度之间的关系，获得若干重要等发酵参数，初步建立重组融合蛋白PFK-K5的高密度发酵及诱导表达工艺条件。
初步探索重组融合蛋白PFK-K5的纯化方法，利用硫酸铵盐析和亲和层析二种方法，特别是亲和层析法，通过联用批量法(Batch法)和柱层析法高度纯化目的蛋白取得良好效果，PFK-K5纯度达94.1％，但回收率仅22.0％，纯化效率有待进一步提高。