【摘 要】
：
目的:基于MS2噬菌体制备沙粒病毒（Arenavirus）核酸检测质评样本（胡宁病毒,Junin virus,JUNV;马丘波病毒,Machupo virus,MACV）,可用于国内开展沙粒病毒核酸检测的EQA活动,以期提高实验室沙粒病毒核酸检测质量。方法:本研究通过查阅大量文献,经BLAST比对选取检测频率高的基因区间序列,送公司分别合成JUNV和MACV基因片段;利用MS2噬菌体病毒样颗粒的表
论文部分内容阅读
目的:基于MS2噬菌体制备沙粒病毒（Arenavirus）核酸检测质评样本（胡宁病毒,Junin virus,JUNV;马丘波病毒,Machupo virus,MACV）,可用于国内开展沙粒病毒核酸检测的EQA活动,以期提高实验室沙粒病毒核酸检测质量。方法:本研究通过查阅大量文献,经BLAST比对选取检测频率高的基因区间序列,送公司分别合成JUNV和MACV基因片段;利用MS2噬菌体病毒样颗粒的表达载体平台,将合成的JUNV和MACV基因片段连接于p ACYC-MS2质粒中,目标重组质粒转入Top 10 E.Coli.感受态细胞中扩增,再对目标重组质粒进行提取、PCR扩增、琼脂糖电泳和测序分析鉴定确认;构建成功目标重组质粒转化至BL21（DE3）E.Coli.中进行诱导性表达、超声破碎菌、分子筛层析柱纯化得到病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,对JUNV和MACV的两种重组病毒样颗粒分别进行了耐酶性试验、SDS-PAGE法、逆转录PCR、琼脂糖电泳以及测序鉴定;最后,用数字PCR对p ACYC-MS2-JUNVVLPS和p ACYC-MS2-MACV VLPS分别进行绝对定量。结果:目标重组质粒的验证:通过PCR验证目的片段大小一致,再提取质粒进行测序验证,测序结果比对吻合度为100%,表明已成功构建目标重组质粒p ACYC-MS2-JUNV和p ACYC-MS2-MACV。病毒样颗粒的鉴定:1.进行耐酶性试验,酶消化后的VLPS在DNA 1,000～2,500bp之间可看到明亮条带;2.经SDS-PAGE法验证病毒样颗粒蛋白分子量约为14KDa,与预期相符;3.提取目标VLPS中的RNA进行逆转录PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳上条带与目的条带大小相同;4.逆转录PCR产物再次进行测序鉴定,测序拼接的顺序与目的基因片段完全吻合,表明已成功制备了包裹有JUNV部分RNA的VLPS即p ACYC-MS2-JUNV VLPS和包裹有MACV部分RNA的VLPS即p ACYC-MS2-MACV VLPS。最终通过数字PCR对p ACYC-MS2-JUNV VLPS和p ACYC-MS2-MACV VLPS进行绝对定量:经RT-q PCR初步估算p ACYC-MS2-JUNV VLPS和p ACYC-MS2-MACV VLPS的表达浓度,再选择适当的稀释样本进行数字PCR,计算得出p ACYC-MS2-JUNV VLPS的拷贝数为9.3×1012copies/m L;p ACYC-MS2-MACV VLPS的拷贝数为2.0×1012copies/m L。结论:本研究成功构建了包裹有JUNV部分RNA的VLPS即p ACYC-MS2-JUNV VLPS和包裹有MACV部分RNA的VLPS即p ACYC-MS2-MACV VLPS,可用于JUNV RT-PCR和MACV RT-PCR检测的阳性质控品,将用于开展JUNV和MACV核酸检测项目的EQA活动,为提高我国实验室JUNV和MACV核酸检测的准确性并推动其标准化进程发挥关键作用。
其他文献
医学影像分割可以获得丰富的解剖结构和病理信息,是辅助诊断、治疗和术后评估的关键。由于医学影像结构复杂,如肿瘤边界模糊,形状不规则等,使得精确的三维脑肿瘤轮廓具有挑战性。因此,基于深度学习的图像分割方法被认为是实现医学图像分割过程中不可缺少的工具,解决了很多难题。然而,生物医学图像分析领域的医疗放射图像主要通过不同的放射仪器获得,如心脏图像可以由X光片、CT和MRI等多种方式获得,由于不同的成像物理
职务犯是罪犯群体中的特殊类型,改造特点与其他类型的罪犯具有明显的差异性。由于职务犯文化程度高、危险程度低,服刑前大多担任一定的领导职务,在服刑期间的劳动岗位安排、刑满释放后的再就业都可能使职务犯产生一定的优越感。监狱机关应对职务犯的改造规律进行科学的研究,加强专管民警队伍建设,使职务犯改造工作多年来没有形成特色,亟待加强和完善。
目的:左心房功能指数（Left atrial function index,LAFI）对急性ST段抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction,STEMI）患者预后的评估价值。方法:连续入组2020年03月到2020年10月湖南省人民医院新诊断为STEMI的患者。所有患者在经皮冠脉介入治疗（Percutaneous coronary inte
目的:分析甲状腺切除术后患者嗓音变化特点,以及早期嗓音训练治疗对甲状腺术后声音异常患者的疗效的初步研究。方法:选取湖南省人民医院耳鼻咽喉头颈外科2019年12月至2020年11月收治的甲状腺肿瘤需行甲状腺腺叶切除或甲状腺全切患者共60例（男性12例,女性48例）,术中常规解剖喉返神经完整,术前、术后引流管拔除当日行频闪喉镜及电子染色成像、嗓音声学分析检查、嗓音障碍指数量表及焦虑自评量表填写,对患者
N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）是真核细胞mRNA上含量丰富且可逆的RNA甲基化修饰形式,在RNA的剪接和翻译中起着至关重要的作用。环状RNA （circular RNA, circRNA）是由前体mRNA反向剪接形成的一类进化保守的共价闭合环状非编码RNA,参与调控多种生理病理过程。近年来,越来越多的研究表明m6A修饰在调节circRNA生物发生、翻译、稳定、核转
目的:研究胎球蛋白A（Fetuin-A,FetA）在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）中的表达及分析其相关影响因素。方法:选取2020年1月-2020年6月在我院健康体检中心行14C-尿素呼气试验及腹部超声检查的患者178例,其中男性86例,女性92例,依据腹部超声检查结果分为NAFLD组与非NAFLD组。收集两组的一般资料（性别、
移动互联网的迅猛发展深刻影响了包括出租车在内的一系列传统行业,重塑了行业生态。滴滴作为一个全国性的出行平台,为民众提供便利的同时,对区域的出租车行业产生了极大的影响和冲击,造成了一定的行业动荡。作为有效补充,发展区域性网约车平台对本地的交管部门和本地交通行业而言是一种应对全国整合的策略,本文就此展开相关研究。本文主要工作如下:第一部分,优化司乘匹配算法。为了有效提高运力的效率,缩短乘客等待时间,本
单元复习是对知识查漏补缺的重要过程,也是提升小学生数学学习能力的有效方式。教师在教学过程中要把握思维导图的教学优势,积极在单元复习过程中应用思维导图去构建单元内容,梳理单元知识结构,从而帮助小学生完成数学学习的任务,同时在梳理的过程中让学生强化知识内容,提升学生数学学习能力。
本研究通过对瘢痕皮下改薄术联合点阵CO2激光对瘢痕疙瘩的临床疗效观察,探讨临床上有效治疗瘢痕疙瘩的方法。方法:1.本研究纳入了在2019年4月到2020年6月期间在我科门诊就诊的20例瘢痕疙瘩患者,所有入选者均符合入选标准。2.联合组:厚度大于4mm的10名瘢痕疙瘩患者(通过高频超声测量瘢痕厚度[1]);激光组:厚度小于等于4mm的10名瘢痕疙瘩患者。联合组的患者一期先行瘢痕皮下改薄术,并于拆线后