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目的： 在单细胞分辨率水平获取可视化的、完整的组织结构信息是科学家们一直以来的梦想，而组织器官的不透光性成为实现这一梦想的最大阻碍。 组织透明化，联合免疫荧光和现代成像技术，成功的打破了传统研究方法的极限，将组织学研究从二维水平升级到三维立体水平。由于不同组织器官的结构不同，透明化条件略有差异。然而目前多数透明化方法均针对脑组织，对于心脏组织的透明化条件及特异性透明化液尚未见报道。在心梗后心脏结构重塑的过程中，完整组织的成纤维细胞表型变化也从未以三维立体的方式呈现出来。本研究旨在探索心脏透明化的特异性条件并发掘其潜在的应用价值。 方法： 1.用排刀切取1.5mm厚的小鼠心脏横断面，并用打孔器经过左室前后乳头肌根部切取直径为4.5mm的小鼠左室全层圆形切片，植入凝胶后使用不同组合的透明化液进行透明，综合比较，选出最优的心脏透明化液。 2.通过循环灌注法以期获得小鼠、大鼠及猪的完整心脏的透明化。 3.结扎左前降支建立小鼠心肌梗死模型，并在心梗后1天、3天、7天、14天分别取材，选取符合条件的组织，用打孔器获取直径为4.5mm的小鼠左室全层圆形切片（心梗部位位于此范围中），并用所获心脏透明化液进行透明。 4.对透明化后的正常组织和心梗组织进行抗体及染料的免疫荧光孵育，并用单光子共聚焦显微镜和光片照明显微镜获取正常组织在单细胞分辨率水平和整体水平的三维立体结构，并在单细胞分辨率水平以三维立体模式展示心梗后左室重构过程中成纤维细胞的表型变化。 5.使用EAL(Electrophoretic Antibody Labeling)即电泳抗体标记法加速免疫荧光过程中的抗体孵育，缩短免疫荧光过程。 结果： （一）SUT和多种已有透明化方法的比较 1.综合多种化学物质的溶解度、透明化组织的光透过率、蛋白丢失率及组织质量和体积增长百分比，最终得到最适的心脏组织透明化液SUT(8％SDS+25％Urea+15％TritonⅩ-100)。 2.就透明化效果而言，SUT透明后的左室全层圆形切片的视觉效果明显优于PBS对照组、ScaleA2组、SeeDB组、CUBIC-1组及PACT组;SUT组的光透过率数值优于SeeDB组(P＜0.001)、ScaleA2组(P＜0.001)、CUBIC-1组(P＜0.001)及其他配方组。 3.SUT透明后的组织蛋白丢失率明显低于PACT的透明化液8％SDS(P＜0.001)，从而更好地保留了组织内的蛋白质，更好地保持了组织结构的完整性。 4.和PACT组相比，SUT透明后的组织质量和体积变化更小(P＜0.001)，更接近组织的原有形态。 （二）SUT与组织免疫荧光兼容 SUT透明后的正常组织经过二重抗体孵育，可用光片照明显微镜进行整体成像，并可用单光子共聚焦显微镜进行单细胞分辨率成像，从而在微观水平解锁心肌的三维立体结构。 （三）通过冠脉循环的全心透明 通过使用自制的灌注装置，并循环灌注透明化液SUT，我们在2天内实现了CD1/ICR小鼠(40克)的全心透明，用时4天完成了Sprague Dawley大鼠(256克)的全心透明，用时29天实现了中华小型猪(35千克)的全心透明。 （四）三维重建心梗后成纤维细胞的表型变化 心梗后1天，左室内膜成纤维细胞数量开始增加，成纤维细胞开始交联。3天时数量达到高峰，成纤维细胞相互交联成块状，无法分辨单个细胞轮廓。心梗后第7天，部分区域单个细胞轮廓分明，细胞变大变圆，间隙增宽，细胞质增多，胞质突起减少。第14天时所有区域的细胞均轮廓分明，细胞间隙增宽，成纤维细胞表型转换完成。 （五）电泳抗体标记法 通过给抗体溶液施加外来电场，使抗体向组织定向移动，提高了免疫荧光效率。 （六）心脏透明化液SUT也可用于小鼠其他实质器官的透明化及成像，如肺、肾、睾丸等。 结论： 本研究结果表明,SUT是一种简单有效的心脏组织透明化方法，相对部分已有的透明化方法具有明显优势。它不仅能在数天内使小鼠心肌组织切片完全透明，而且可在数天内完成小鼠和大鼠的全心透明，并可实现完整猪心的透明。结合免疫荧光和现代成像技术，可以在单细胞分辨率水平构建出心脏组织的三维立体结构，并可用三维立体模式对疾病的机制进行探索。尽管目前EAL方法并不完善，但它为提高免疫荧光的效率提供了一种可能的途径。