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禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的禽流感疫病能给养禽业带来严重损失,同时还威胁着人类健康。疫苗免疫是控制禽流感的有效措施。传统疫苗需要注射免疫,操作复杂,且不能常温保存。利用S-层蛋白在芽孢杆菌表面展示病原体抗原的特性和芽胞的耐热性,可以开发出口服且具有热稳定性的疫苗。本研究室已利用S-层蛋白在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)表面分别表达了多种禽类病原体抗原(刘梅等,2007；Liu et al.,2008a；Liu et al.,2008b),其中,用表达禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)H5亚型血凝素HA1的重组菌株免疫雏鸡后,雏鸡产生了AIV-H5亚型的特异性抗体,但抗体效价(3.8(log2))与实际使用标准(4(log2))尚存在一定差距。故本研究在刘梅等(2007)的研究基础上,利用霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit, CTB)能提高黏膜免疫的特性,将CTB和HA1融合表达在Bt菌株BMB171表面,以期提高HA1免疫抗体效价,为研制耐热口服禽流感疫苗打下基础。1.血凝素基因hal和霍乱毒素基因ctb的克隆及重组质粒构建PCR扩增目的基因hal和ctb,同时在保证氨基酸序列不变的基础上对目的基因的EcoRI和HincⅡ P艮制性酶切位点进行点突变。通过重叠延伸PCR技术获得两种融合基因ctb-hal和ctb-linker-hal。在表达载体pBMB982-304中S-层蛋白基因ctc的HincⅡ/XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,分别插入目的基因和操纵子csa AB,得到重组质粒pCSCH (csa-ctc-ctb-hal), pCSCLH (csa-ctc-ctb-linker-hal)和对照质粒pCSCTB (csa-ctc-ctb), pCSHAl (csa-ctc-hal)。2.含融合基因的重组菌株的构建及HA1的表达情况用电脉冲法将重组质粒转入苏云金芽胞杆菌BMB171中,得到重组菌株MICTB(含pCSCTB), MIHA1(含pCSHAlX MICH (含pCSCH)和MICLH(含pCSCLH)。用血凝和血凝抑制试验检测上述4种重组菌株血凝素HA1的表达情况。结果显示,MIHA1、 MICH和MICLH均有血凝活性,标准阳性血清能够抑制重组菌株的血凝能力,表明HA1蛋白在BMB171表面得到表达且具有活性。3.重组菌株的遗传稳定性重组菌株MICH和MICLH在无抗性LB培养基中连续培养50代,每间隔10代用Erm抗性LB平板检测质粒稳定性。结果显示,MICH培养50代后质粒稳定性为80%；MICLH培养30代后稳定性为86%,50代后质粒基本丧失。4重组菌株对雏鸡的免疫原性MICH和MICLH培养至稳定期离心收集菌体,用1×109CFU菌液口服免疫艾维因肉雏鸡3次,检测血清IgG-HA1和黏膜SIgA-HA1抗体水平,直接ELISA检测黏膜总IgA效价。ELISA和HI结果显示,免疫重组菌株MICH的雏鸡血清,一免后HA1特异性抗体水平上升,之后抗体水平逐渐下降；而免疫重组菌株MICLH免疫的雏鸡,其IgG抗体水平升高不显著。洗液SIgA-HA1检测结果显示,MICH气管黏膜IgA虽与对照组差异显著,但ELISA最高值也仅为0.113(OD450)。总IgA检测发现,MICH试验组能够诱导鼻腔、气管和肠道黏膜产生高水平的总IgA,但只有鼻腔总IgA水平差异显著。动物实验结果表明,试验组体液免疫和局部抗体效价虽有升高,但升高幅度不显著,CTB的免疫佐剂作用未能发挥,难以实际应用。