论文部分内容阅读
研究背景骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，好发于负重较大的膝关节等部位，是由于多种机械性和生物性因素相互作用所致，其具体的病因和发病机制目前尚不明确。膝关节是人体最复杂也是最大的关节，对人体下肢运动和载荷支撑起着非常重要的作用，关节软骨作为关节的重要组成部分，与人的其它体细胞相比，处于关节内特殊的压力环境之中，具有独特的结构与力学特性，致使其代谢和功能也必然受到压力的影响和调控。许多骨关节炎相关的动物模型也证实了骨关节炎的疾病进展过程与压力密切相关，尤其是静水压力对软骨新陈代谢的影响。Ⅱ型胶原、IL-1β、TNF-α、MMP-13作为与骨关节炎的发生发展具有高度相关性的细胞因子和蛋白，若能证明其在压应力与骨关节炎疾病间具有纽带作用，则对研究关节压应力与骨关节炎发病和进展的相关性具有重要意义。研究目的本研究拟建立一个理想的人软骨细胞压力实验模型，以更好的模拟人承重关节内部的压力环境，为进一步研究压力对关节软骨细胞影响的奠定实验基础。通过高强度静水压力实验,试从细胞学层面探讨高强度压力与人关节软骨退变、骨关节炎之间的关系。研究方法1.通过临床上获得的正常膝关节软骨组织和骨关节炎软骨组织，经两步酶消化法获取原代正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞，传代并观察；甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定软骨细胞；基于自行设计的多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置建立人软骨细胞压力实验模型。2.通过多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置对实验组软骨细胞分别施加3.0MPa、7.0MPa、10.0MPa的静水压力，每天加压培养2h，共5d；通过CCK-8、MTT、流式细胞仪检测软骨细胞经不同压力处理后的增殖和凋亡情况；根据压力实验数据对建立的人软骨细胞压力实验模型进行评估。3.通过多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置分别对正常软骨细胞组和骨关节炎软骨细胞组施加10.0MPa静水压力，每天加压培养2h，共5d；通过qRT-PCR和Western-Blot检测压力处理后各组软骨细胞中Ⅱ型胶原、IL-1β、TNF-α和MMP-13的分泌和表达情况。研究结果1.通过原代培养从临床上获得的活力较高的膝关节正常软骨细胞和病变明显的膝关节骨关节炎软骨细胞，其更符合人类的生物学特点。多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置能有效模拟生理情况下人膝关节内的静水压力负荷。2. CCK-8、MTT、流式细胞仪检测显示，与对照组相比，3.0MPa压力能促进软骨细胞增殖，抑制凋亡；7.0MPa压力可致软骨细胞增殖能力的下降和细胞凋亡率升高；10.0MPa压力导致软骨细胞增殖能力的大幅下降和明显的细胞凋亡趋势。人软骨细胞压力实验模型经实验评估，证实其性能稳定、安全可靠、可重复性强，可以有效的模拟人关节内的压力环境。3. qRT-PCR和Western-Blot检测结果显示：正常软骨细胞或骨关节炎软骨细胞经高强度静水压力作用后，都表现出对Ⅱ型胶原表达的抑制，和对IL-1β、TNF-α和MMP-13表达的促进作用；经高强度静水压力作用后，骨关节炎软骨细胞与正常软骨细胞相比，Ⅱ型胶原的表达下降，MMP-13和IL-1β的表达升高，而TNF-α的表达差异不明显。结论1.本研究从临床上获取人膝关节软骨组织，通过原代培养，获得活力较高的膝关节正常软骨细胞和病变明显的膝关节骨关节炎软骨细胞，其更符合人类关节内的生物学特点，研究结果可信度更高。建立的人软骨细胞压力实验模型更贴近人类，可以更好的模拟人承重关节内部的压力环境，较动物模型更具优势。2.利用本压力实验模型，初步确定了人软骨细胞压力实验中的压力梯度选择，证实了不同强度的静水压力对人膝关节软骨细胞的增殖和凋亡会产生不同的影响。经过实验评估，证明此压力模型可以安全稳定的向培养的细胞施加静水压力，用于各类静水压力影响相关的实验。3.超过生理水平的高强度静水压力不仅可直接影响软骨细胞新陈代谢，造成细胞损伤，引起细胞凋亡，还能通过抑制Ⅱ型胶原合成，促进IL-1β、TNF-α和MMP-13的分泌表达，从而间接的导致软骨支撑作用和保护机制的减弱，加快关节软骨的退变，使正常的软骨细胞向骨关节炎样细胞转化，或加重骨关节炎的病理改变。