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目的:输卵管妊娠(TEP,tubal ectopic pregnancy),是异位妊娠疾病最常见的类型。多发于早期妊娠,是导致产妇死亡率高的疾病之一。临床上发病机理尚不明确,诊断方面也尚未发现特异、灵敏的生物蛋白可以作为标志物。本研究通过对人输卵管全蛋白表达谱,及正常输卵管的蛋白定量功能分析;对输卵管妊娠疾病与正常输卵管及相关组织的差异蛋白的研究,解析有并筛选差异生物蛋白;研究中西结合药物治疗与否的差异蛋白,筛选潜在的有效治疗相关差异靶蛋白。本次研究通过iTRAQ技术结合质谱差异蛋白及正常输卵管全蛋白表达谱的研究,高通量法为鉴定输卵管妊娠疾病相关的异质性特异蛋白分子提供基础,期望对输卵管妊娠的疾病发生发展机制研究和药物干预靶蛋白研究提供参考;富集出的低丰度差异蛋白能够对输卵管妊娠疾病的诊断所需的Biomarker提供参考。方法:1.本研究运用 8 标 iTRAQ((8-plex isobarie Tags for Relative and Absolute Quantitation)技术结合LC-MS/MS,采用混合池(pool)的研究策略,研究以人输卵管妊娠疾病中种植部位输卵管组织(PT),非种植部位输卵管组织(UPT),妊娠绒毛组织(V)作为实验组;对照正常人输卵管组织(NT),正常宫内妊娠绒毛组织(NV)和宫内临近蜕膜组织(ND)。实验组:2例输卵管妊娠疾病用中西医结合药物后输卵管组织MPT1(Ml),MPT2(M2)与未用药物输卵妊娠疾病的输卵管组织PT对照。差异蛋白组的对比方案:PTvsNT,PTvsUPT,PTvsUPTvsNT,VvsNV,PTvsND,PTvsMl,PTvsM2。用SAM运算法,筛选对输卵管妊娠疾病有临床意义的特异蛋白。2.对正常输卵管无标记(label free)全蛋白表达谱研究,分析其全蛋白生物功能及其特性,从输卵管生理机制角度,摸索输卵管妊娠疾病发生病理条件的相关生物蛋白。3.针对综合临床相关因素集成筛选出候选蛋白的参数条件,得出12个蛋白,其中6候选蛋白进行原样本和新增样本的免疫组化验证(IHC)。结果:1.上述差异蛋白研究组,在两次重复标记,4次质谱(技术重复4次),交集最稳定出现了 4次的差异蛋白中,根据定性和定量结果,按照SAM评分标准结果如下:PTvs NT:上调蛋白416个,下调蛋白103个;PT vs UPT:上调蛋白216个,下调蛋白79个;PT vs UPT vs NT(逐级):上调蛋白601个;V vs NV:上调蛋白168个,下调蛋白85个;PT vs ND:上调蛋白360个,下调蛋白151个;M1 vs.PT:上调蛋白120个,下调蛋白145个;M 2 vs.PT:上调蛋白166个,下调蛋白198个;2.文中仅展示了 PTvsNT,PTvsUPT,PTvsUPTvsNT,VvsNV,PTvsND 的评分前的30蛋白;而药物组全部展示,为以后临床筛选药物干预靶蛋白提供参考。根据临床价值特性设定条件集合,优选出10个前位蛋白:KRT1、FN1、HSPG2、KRT9、KRT7、FGA、HBB、HBA1、FGB、FGG;仅完成了 6 个蛋白(KRT1、FN1、HSPG2、KRT9、KRT7、FGA)的IHC验证。富集到低丰度且输卵管妊娠发生机制解析密切相关的pathway类代表:生长因子相关通路(mTOR signaling);炎性因子相关通路(IL-8 signaling);侵袭因子相关通路(RhoGDI signaling)。3.正常输卵管进行了 2次技术重复,并进行DAVID富集分析,Pathway mapping,HPA库中匹配等分析,质谱共鉴定处蛋白数5416(第一次5177,第二次3712),其中高丰度630个,中丰度3605个,和1181低丰度个;3个明显高富集的3个Pathway是网格蛋白(Clathrin)内吞作用的囊泡蛋白,Caveolar介导内吞蛋白信号(caveolar mediated endocytosis signaling),肌动蛋白细胞骨架信号通路(actin cytoskeleton signaling pathway);人输卵管中含有大量的间充质干细胞(MSCs,mesenchymal stem cells)[1],相关蛋白丰度(Benjamini=6.8×10-118);大量低丰度蛋白中识别和输卵管功能密切关联的蛋白:黏蛋白(mucins,MUC1),输卵管特异性糖蛋白(oviduct specific glycoprotein 1,OVGP1),微管蛋白(beta-tubulin Ⅳ,TUBB4B),孕酮受体(progesterone receptor,PGR),膜相关孕激素受体成分-1(membrane-associated progesterone receptor component 1,PGRMC1)and-2(PGRMC2),雌激素受体γ(estrogen related receptor gamma,ESRRG),抑制素 α(inhibin alpha chain,INHA),抑制素 βA(INHBA),内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,NOS3),一氧化氮合成酶相关蛋白(nitric oxide synthase interacting protein,NOSIP)和表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)等;对比现有最新研究进展的Rungruangdata 库,得出其中 7 个新发现蛋白 PGRMC1,PGRMC2,ESRRG,INHA,INHBA,NOS3 和 NOSIP。4.对其中6个蛋白KRT1、FN1、HSPG2、KRT9、KRT7、FGA做小样本IHC验证得出:在PT与NT比较中,KRT9、FGA和KRT1蛋白的P值<0.05有显著差异;6个蛋白在本次验证中PTvsUPT结果均无显著差异。结论:1.筛选出并经过IHC蛋白验证的KRT9、FGA和KRT1蛋白,有可能成为临床中西医结合(活血化瘀消癥中药复方结合米非司酮/MTX)药物治疗输卵管妊娠疾病的重要分子靶向,也可能作为后期输卵管机制研究相关的重要蛋白,仍做进一步扩大临床样本量,并多角度进行验证。HBB、HBA1、FGB、FGG等蛋白有待进一步相关验证确定其价值。2.从Human Protein Atlas(HPA)数据库中查询6个已用IHC验证候选蛋白在正常输卵管中的IHC和RNAseq数据,其中发现KRT1和FGA在蛋白和转录本水平,以往均无在输卵管中表达的证据。即两个蛋白在我们的IHC验证中发现NT上有表达可作为新发现之一。