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目的:1.构建支气管上皮细胞(BEAS-2B cells)和中性粒细胞(Neutrophils;NEU)混合培养体系。2.探讨支气管上皮细胞与中性粒细胞相互作用时,诱导细胞表面粘附分子表达及细胞因子(IL-6、IL-8)分泌的机制。 方法:1.采用免疫磁珠阳选法分离纯化人外周血中性粒细胞,与支气管上皮细胞混合培养,构建实验体系。2.实验随机分成6组:①:单独培养的支气管上皮细胞组(BEAS-2B组);②单独培养的中性粒细胞组(Neutrophils组);③支气管上皮细胞和中性粒细胞混合培养组(BEAS-2B+Neutrphils组);④混合培养并加入抑制剂SB203580组(B+N+SB203580组);⑤混合培养并加入抑制剂MG-132组(B+N+MG-132组);⑥混合培养并加入抑制剂SB203580和MG-132组(B+N+SB203580+MG-132组)。3.应用流式细胞术(FCM)检测BEAS-2B细胞和NEU细胞表面粘附分子(ICAM-1、ICAM-3和VCAM-1)的表达;应用western blot技术检测BEAS-2B细胞内NF-KB及p38MAPK通路的激活;应用Real-time PCR法检测上述细胞中ICAM-1、ICAM-3和VCAM-1的基因表达;应用Roche Cobas e411和ELISA技术检测细胞培养上清液中IL-6和 IL-8的分泌。 结果:1.用免疫磁珠阳选法可以分离得到纯度>98％、活力>98%的中性粒细胞。2. BEAS-2B细胞表面粘附分子的表达:BEAS-2B细胞和NEU细胞混合培养, BEAS-2B细胞表面粘附分子ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的表达较其单独培养时明显增高;加入抑制剂后,三种粘附分子的表达均有明显减低;ICAM-3、VCAM-1对两种抑制剂的敏感程度并无明显差异,且未发现两种抑制剂间的相互作用;MG-132对ICAM-1的抑制作用明显强于SB203580,并且两种抑制剂联合使用可进一步降低ICAM-1的表达。3.中性粒细胞表面粘附分子的表达:BEAS-2B细胞和NEU细胞混合培养,中性粒细胞表面ICAM-1的表达较其单独培养时明显增高;加入抑制剂(SB203580、MG-132)表达量明显下降。4.与BEAS-2B细胞单独培养组相比,混合培养组BEAS-2B细胞ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的基因表达水平明显上调;与单独培养NEU细胞相比,混合培养组ICAM-1的基因表达水平也明显上调。5.western blot结果显示BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养可以诱导BEAS-2B细胞体内Phospho-IKB及Phospho-P38MAPK蛋白的表达。6.BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养时,细胞培养上清液中IL-6的表达量明显增加,加入抑制剂(SB203580、 MG-132)均可抑制IL-6的分泌,且MG-132的抑制效果强于SB-203580,同时两种抑制剂联合使用有协同作用;.7. BEAS-2B细胞与NEU细胞混合培养,细胞培养上清液中IL-8的分泌无变化。 结论：1.免疫磁珠阳选法可以分离得到高纯度、高活性的中性粒细胞。2.BEAS-2B细胞与中性粒细胞接触后相互作用可活化BEAS-2B细胞内NF-KB和P38MAPK通路,进一步诱导相关基因的表达,从而调控细胞表面粘附分子ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1及炎症因子(IL-6)的表达。