水稻叶色突变体lc7基因的图位克隆及功能研究

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通过Co60γ射线辐射诱变水稻日本晴种子,我们共获得了320种形态异常突变体和43种抗白叶枯菌PXO99小种的突变体,突变频率为10.3%。其中一个突变体叶色异常,我们将其命名为lc7((l)eaf(c)olor7),此突变体中叶绿素含量比野生型降低一倍左右。透射电镜观察发现突变体类囊体结构异常,片层数变少,甚至没有任何片层结构;lc7突变体除叶片叶绿体缺陷性状外,还表现矮化、分蘖数减少、结实率、种子千粒重降低和晚熟等不良表型,表明lc7突变对植物生长和发育的影响具有多效性。  此外,叶片中存在不均匀分布的褐斑,经台盼蓝染色显示突变体叶上的褐斑部位的细胞都是活细胞,DAB染色显示该部位活性氧含量显著上升,暗示细胞发生了氧迸发。过量活性氧也能使植物受到伤害,因此植物体内激活了活性氧清除系统,我们测量突变体中一些重要的酶促活性氧清除酶如SOD、APX、DHA、GR、CAT和非酶促系统如GSH等的活性,结果表明这些酶活性都显著升高。  遗传分析表明lc7突变体由单个核基因突变造成。通过精细定位获得了lc7的候选基因。序列分析显示lc基因全长14,570bp,由26个外显子组成,编码一个具有1615个氨基酸残基的依赖铁蛋白的谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT),经测序发现在第二个外显子内一个碱基发生替换,突变位点位于Fd-GOGAT的N端谷氨酰胺氨基转移酶结构域,造成蛋白构象改变。与已知其它蛋白质有非常保守结构域,进化树分析表明,GOGAT家族蛋白可明显地分为两类:FD-GOGAT和NADH-GOGAT。  将正常谷氨酸合成酶基因转入lc7突变体,互补转基因植株叶色表型能恢复正常;过表达转基因植株也恢复了正常叶色表型。以上表明我们已成功克隆了lc7基因。RT-PCR分析表明,lc7基因在所有各个组织中均有表达,特别是在成熟叶片中的表达量最高。  鉴于lc7突变体自发产生大量的活性氧,暗示了与抗病相关,我们对其又进行白叶枯病抗谱分析,发现其对菲律宾白叶枯菌7个小种表现高抗。病程相关蛋白的表达分析表明,在突变体中OsPR1a,OsPR1b,OsPR2,OsPR3,OsPR5能显著上调,特别是OsPR1a,OsPR3还受到PXO99诱导上调。  为了更深入研究lc7的功能,我们做了数字表达谱测序,结果发现lc7突变体的大量叶色和抗氧化相关基因如过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶等和抗病相关基因的表达水平明显上调,说明植物细胞激活了体内的活性氧清除系统以清除体内过多积累的活性氧。  我们还检测了硝态氮含量,发现lc7突变体总氮和硝态氮的含量比野生型高,而铵态氮却相反,叶片中硝态氮含量比野生型日本晴降低了一倍左右,然而在lc7突变体根中硝态氮含量比野生型日本晴有所增加,说明lc7可能参与了植物氮素的同化和转运过程。  以上结果表明,lc7在叶绿素合成、氮代谢和广谱抗病中具有多重的生物学功能,因此研究lc7具有重要的研究价值。
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