水貂Toll样受体5编码区基因的克隆、分析及其激动剂的表达

• 作 者: 姜合祥
• 机 构: 青岛农业大学
• 出 处: 青岛农业大学
• 发表日期: 2017年期
• 关键词: 毛皮动物 水貂养殖 动物免疫 蛋白表达

为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系，采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总 RNA中克隆出TLR5基因的片段，经拼接获得全长编码区序列。序列全长2577bp，编码858个氨基酸，含17.2%的亮氨酸，并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明，该分子具有亲水性，由胞外区（具有LRR结构域）、跨膜区和胞内区（具有 TIR结构域）组成，表现出典型的TLR家族结构特征；同源性分析结果显示，与蒙眼貂同源性最高，达97%以上，与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上，其他物种大都在70%以上，在系统发育树中同源性越高，亲缘关系越近，说明TLR5基因在进化过程中具有高度保守性。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础，也有利于毛皮动物抗病分子机制与模式的研究。鞭毛蛋白作为Toll样受体5（Toll-like receptor5，TLR5）的天然激动剂，可与TLR5结合诱导天然免疫应答，刺激较强细胞免疫应答的产生，是近年来研究较热的新型免疫佐剂。　　本研究比对分析了貂源绿脓杆菌SD01菌株鞭毛蛋白（PAfliC）与其它菌种鞭毛蛋白的氨基酸序列，预测了TLR5与PAfliC二者相互作用的关键氨基酸位点，使用 PCR的方法克隆了 PAfliC和其删掉高变区的突变体（rPAfliC-ΔD2），构建了pColdⅠ-PAfliC和pColdⅠ-rPAfliC-ΔD2表达质粒，将两个重组表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。结果证实重组菌表达2种蛋白大小分别约为32KD和42KD，主要存在于上清中，且均与兔抗水貂绿脓杆菌阳性血清发生特异性反应，表明两个重组蛋白成功表达。为进一步明确水貂TLR5与PAfliC的作用位点，比较不同鞭毛蛋白的佐剂活性奠定了基础。