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从20世纪80年代开始，生长因子在皮肤伤口愈合过程中的重要作用逐渐被人们所认识。伤口局部应用某些外源性生长因子可以明显提高皮肤的自我修复能力，与传统的治疗方法相结合，能有效地提升治疗的效果并且缩短治疗的周期。目前已有50多种生长因子相继被发现，它们分别归属于五大家族：表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-beta)、血小板源性生长因子(PDGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族。
血管生成素相关生长因子(AGF)是血管生成素相关蛋白家族(ARPs)的新成员，其转基因小鼠皮肤潮红，耳朵、口唇部位充血，组织学特征表现为皮肤真皮层微血管大量增生，表皮层异常增厚。与正常小鼠比较，这种小鼠皮肤伤口的愈合速度明显加快。籍此，AGF被认为是一种新的能够促进皮肤伤口愈合的生长因子，具有潜在的开发和应用价值。但是，至今对其伤口愈合相关生物学功能的认识仍然停留在转基因动物水平，缺乏直接基于蛋白的系统研究。本论文在纯化的重组蛋白的基础上，以主要的三种伤口愈合相关细胞——表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞为研究对象，对人AGF促进伤口愈合可能的细胞学机制进行了系统的研究。
按研究进程，我们将本论文分成四章叙述。在第一章中，我们用序列分析软件和公共生物学数据库对人AGF及其基因序列进行了系统的解析，目的是了解基因和蛋白的结构特点，为相关的生物学功能研究提供线索和依据。人AGF编码序列全长1413bp，平均GC含量达到64％，对应的蛋白多肽链由470个氨基酸(aminoacid，aa)组成，其中1-20aa为信号肽，21-470aa为成熟蛋白，理论分子量为50KD。同其它血管生成素相关蛋白家族成员类似，人AGF蛋白N端包含两个螺旋卷曲结构域(Coiled-coil domain：57-119、136-174aa)和一个纤维蛋白样结构域(Fibrinogen-like domain：258-468aa)。人AGF序列中还包括2处潜在的N糖基化位点和4处0糖基化位点，以及7个家族保守的半胱氨酸(分别位于第27、43、185、260、287、410和423位残基)，这些信息提示人AGF可能是一种糖蛋白，分子中有形成链内和/或链间多对二硫键的可能，而链间的二硫键可使蛋白在自然状态下以聚体形式存在。从进化树和序列相似性上分析，人AGF与同一家族中ARP1和ARP2的同源性最高，分别达到40.7％和43.2％，而与另两个成员，ARP3和ARP4，仅有20.2％、21.1％的同源性。我们用UniGene数据库对人和小鼠AGF的组织表达谱进行了分析，发现人AGF仅在脑、血小板和小肠中呈现微弱的表达，而小鼠AGF则在小脑、肝、胰、肺、脾、膀胱、皮肤、内分泌腺和胚胎等多个组织中都有一定程度的表达。最后，我们用Prosite数据库对人AGF的序列模体进行了全面的分析，结果显示人AGF含有以下多种序列模体：13处肉豆蔻酰化位点、6处蛋白激酶C磷酸化位点、2处N-糖基化位点、1处cAMP和cGMP依赖性磷酸化位点、3处酪蛋白激酶H磷酸化位点、1处酪氨酸硫酸化位点、1处RGD细胞粘附序列和1处酪氨酸激酶磷酸化位点。其中，RGD序列存在于多种细胞外基质蛋白序列中，通过与细胞表面特定的整合素分子结合介导伤口愈合相关细胞的粘附、移行、增殖等功能，在正常的伤口愈合过程中起着十分重要的作用。进一步的序列联配结果表明，在人血管生成素和血管生成素相关蛋白家族中，唯人AGF序列含有此RGD序列，并且它在不同的哺乳动物(人、小鼠、大鼠、狗)间保守。这一发现提示AGF参与伤口愈合的机制可能和RGD序列有关。
在第二章中，我们克隆了人AGF基因，并在哺乳动物细胞中实现了重组蛋白的表达和纯化。我们从人基因组上扩增了人AGF编码序列的1-526bp片段，从肝cDNA文库中扩增了513-1413bp片段，两片段经PCR融合合成了全长的人AGF编码序列。为了在哺乳动物细胞中实现高分泌表达，我们用强信号肽(大鼠血清白蛋白信号肽，RSAL)序列取代了人AGF自身的信号肽序列，为了方便后续的纯化工作又在异源信号肽前面融合了6xHis标签，最后将完整的表达序列克隆入pcDNA3载体构建成真核表达质粒pcDNA3/RSAL-His-hAgf。质粒转染NIH/3T3细胞，经G418(750μg/ml)筛选18天形成单克隆，挑选15个克隆比较分泌表达量(Dot blot半定量法)，选择产量最高的克隆用于放大规模培养。混合两批分泌培养液(约1升)，加固体硫酸铵至85％使目的蛋白沉淀，用缓冲液溶解后直接上镍柱纯化，最后得到1.8ml浓度约为420μg/ml的重组人AGF蛋白，纯度达到90％。通过还原和非还原SDS-PAGE胶电泳结果判断，在天然状态下，人AGF至少以四聚体形式存在，单体的实际分子量约为66KD，明显大于理论值50KD。 在第三章中，我们研究了重组人AGF调节伤口愈合相关细胞(表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞)增殖、粘附和移行的功能。MTT细胞增殖实验的结果显示，重组人AGF仅在高浓度时(浓度达到μg／ml)时表现出促进 皮肤角质细胞(HaCaT)增殖的功能，对成纤维细胞(NIH／3T3)和血管内皮细胞 (PIEC)都无刺激增殖作用。但是，体外的粘附实验证实包被在固相载体表面的 人AGF能有效地支持角质形成细胞(HaCaT)、成纤维细胞(NIH／3T3)和血管内皮细胞(PIEC)的粘附和伸展，而且这种作用呈现明显的剂量一效应关系。人AGF对三种细胞的粘附曲线相似，当浓度为2—3μg／ml时，粘附达到最高值，随着蛋白浓度的继续增加，粘附进入并维持在平台期。观察细胞的形态和伸展情况发现，当细胞与固相的人AGF接触约20-30分钟后，细胞发生粘附并开始伸展，三种细胞在2小时内都能实现完全的伸展。进一步的粘附抑制实验显示，人AGF对HaCaT,NIH／3T3和PIEC的粘附作用可被线性多肽RGDS(竞争性结合细胞表面的RGD结合整合素)和环行多肽GPenGRGDSPCA(竞争性结合 RGD结合整合素中的α<,v>整合素)抑制，而且这种抑制作用随着多肽浓度的增高而增强。对HaCaT,NIH／3T3和PIEC三种细胞，RGDS分别在200μM、250μM和700μM浓度时实现50％粘附抑制率，GPenGRGDSPCA则在8μM、25μM和100μM浓度时实现50％粘 附抑制率。两者相比，达到相同的抑制率，GPenGRGDSPCA的浓度仅为RGDS的1／25、1／10和1／7，约为一个数量级的差异。这些结果表明，人AGF对角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的粘附作用是由细胞表面的RGD结合整合素介导的，而且最有可能是其中的α<,v>整合素。接着，通过Transwell细胞移行实验我们发现，人AGF对角质形成细胞(HaCaT)、成纤维细胞(NIH／3T3)和血管内皮细胞(PIEC)都有剂量依赖的化学趋化作用，可引起细胞的定向移行。移行抑制实验显示，人AGF(4μg／ml)对三种细胞的趋化作用都可以被200μM GPenGRGDSPCA环肽抑制：HaCaT细胞移行被抑制了62％；NIH／3T3细胞移行被抑制了68％；PIEC细胞移行被抑制了52％，而对照线形短肽RFDS未能产生抑制效果。这些结果表明，角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞表面的RGD结合整合素(最有可能是其中的α<,v>整合素)介导了人AGF诱导的趋化移行作用。
在第四章中，我们建立了皮肤创伤小鼠动物模型，并利用此模型对外用重组人AGF能否促进皮肤伤口愈合进行了研究。我们选用昆明种小鼠，在其下背部制造两个对称的圆形伤口(直径约0.8cm)，对照侧涂抹林可霉素利多卡因凝胶(商品化凝胶制剂)，用药侧涂抹掺入人AGF(2μg／ml)的林可霉素利多卡因凝胶，两个伤口每天各涂抹一次，连续五天。三天后，用药侧伤口发生明显的收缩，伤口直径小于对照侧。五天后，伤口直径的差别达到最大，用药侧伤口显著地小于对照侧伤口。之后，两者的差别不再扩大，到第十天时，对照侧伤口也完成了良好的收缩和闭合，其直径与用药侧不再有明显的差别。选第五天时两侧伤口差异最显著的一只小鼠引颈处死，取对照侧和用药侧伤口全层皮肤做组织切片和HE染色。结果显示，用药侧表皮层细胞增生、移行速度加快，再上皮化进程明显优于对照侧。本章动物实验的结果表明，外用重组的人AGF能够有效地促进皮肤伤口的收缩和再上皮化进程，缩短伤口愈合的时间。
通过从序列到功能的系统研究，我们认为人AGF具有细胞外基质蛋白典型的结构和功能，这一全新的认识为进一步研究此分子促进伤口愈合的分子机制研究奠定了良好的基础。我们也在重组蛋白的基础上证明了人AGF能直接、有效地促进皮肤伤口的愈合，具有进一步开发成治疗性药物的价值和潜能。