论文部分内容阅读
本研究首先以广东观赏鸟体内分离的几株疑似病毒为研究对象，依次对其进行了血清学与分子生物学鉴定以及病毒形态的电镜观察。经HA和HI鉴定，共获得8株H9亚型禽流感病毒和2株新城疫病毒。采用蔗糖密度梯度离心对病毒液进一步纯化，经透射电镜观察，可见该疑似病毒具有禽流感病毒及新城疫病毒直径大小相符的病毒粒子以及囊膜、纤突等形态特征。
根据GenBank中注册的H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列以及新城疫病毒F基因序列分别设计一对特异引物，采用RT-PCR方法扩增相应的目的片段，将cDNA片段分别克隆至pMD—18T载体进行序列测定。共获得禽流感5个毒株的HA全基因序列和NA基因部分序列以及一株新城疫F基因的部分序列。序列分析结果表明：5个毒株的HA基因cDNA长度均为1683bp，编码560个氨基酸，NA基因部分cDNA长度均为707bp；新城疫F基因部分cDNA长度为1625bp。5个毒株彼此间的HA核苷酸序列的同源性在99.3％～99.9％，氨基酸同源性在98.9％～99.6％。HA蛋白上共有8个糖基化位点，其中6个位于HA1蛋白上，另外2个位于HA2蛋白上，受体结合位点216位为M。HA蛋白切割位点的氨基酸组成为R—S—S—R，为低致病性毒株的典型特征。系统发育进化分析表明，这些毒株均属欧亚种系的Beijing亚群，亚群内的同源性在94.8％以上。5个毒株NA彼此间核苷酸序列的同源性在99.6％～100％，氨基酸同源性在99.1％～100％，彼此间相似性很高。经NCBI BLAST在线分析表明：5个毒株的HA全基因和NA基因部分序列与参考株A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性均为最高，达98％。而获得的新城疫毒株属于基因Ⅶ型，F蛋白氨基酸的裂解位点为112R—R—Q—K—R—F117，具有典型的强毒株特征；F0氨基酸序列中有6个糖基化部位点和3个与病毒融合相关的重要抗原位点。
根据GenBank数据库中发表的禽流感病毒(AIV)H5和H9亚型编码血凝素的HA基因及新城疫病毒(NDV)编码融合蛋白的F基因序列，按照多重PCR反应引物设计原则，分别在其基因保守区设计出3对特异性引物，扩增片段大小分别为386bp(AIV—H5)、492bp(AIV—H9)和636bp(NDV)。首先建立了单项RT-PCR检测方法，对各引物PCR反应时的退火温度、引物浓度、镁离子浓度等进行了优化。在此基础上，组合成AIV—H5—AIV—H9—NDV多重RT-PCR反应，并对多重RT-PCR反应的引物浓度、共同的退火温度进行了优化，建立了AIV—H5—AIV—H9—NDV多重RT-PCR诊断体系，对该方法进行了敏感性、特异性及重复性试验。结果显示：该诊断方法敏感性高，特异性强，重复性好，为观赏鸟禽流感和新城疫两种病毒分子检测试剂盒的研制奠定了基础。