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目的hCu,Zn-SOD-TAT PTD表达载体的构建及其体外表达,表达产物的纯化及对其跨膜转运能力的初步研究.方法先从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu,Zn-SOD基因,插入pUC19测序;以测序质粒为模板,苒用含TAT PTD编码序列的3引物PCR扩增得hCu,Zn-SOD-TAT PTD融合基因,并插入pUC19.以限制性内切酶酶谱分析和DNA序列分析两种方法鉴定阳性克隆.然后将SOD基因和SOD-TAT PTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体pJW2,转化大肠杆菌DH5 α,热击诱导表达,表达蛋白主要以包含体形式存在.SOD和SOD-PTD重组蛋白经初步复性纯化后,进行酶活力测定.将纯化后的重组蛋白与WISH细胞进行短时间温育,检测细胞裂解液SOD酶活力大小.结果经限制性内切酶酶谱分析和DNA序列分析证明所构建质粒分别为pJW2-SOD和pJW2-SOD-TAT PTD重组质粒.SDS-PAGE和Westernblot结果表明,分别在19ku和22ku处出现SOD和SOD-TAT PTD目标表达条带.复性蛋白质经离子交换层析后均达到了电泳纯.复性纯化后的SOD和SOD-TAT PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性,其比活性分别为12×10<3>NU/mg和9.9×10<3>NU/mg.WISH细胞在加有rhCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的培养液中进行短时间温育后,细胞裂解液中SOD活力明显上升.结论成功构建了hCu,Zn-SOD-TAT PTD的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达且对表达产物进行了有效的复性和纯化,得到了具有SOD酶活力的rhCu,Zn-SOD-TAT PTD融合蛋白.细胞试验结果表明,与SOD蛋白相比较,SOD-TAT PTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力,提示TAT PTD能有效介导SOD跨膜进入细胞.