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人肝再生增强因子(hALR)是一种肝源性细胞因子,能特异性地刺激肝细胞的再生,并对肝毒剂引起的肝损伤有治疗作用。目前文献报道中,虽然在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和巴斯德毕赤酵母构建了体外重组表达系统,但是关于hALR的相关研究工作多集中在其作用机制上。鉴于大肠杆菌表达系统的局限性,获得活性蛋白的胞外高效表达对于hALR的应用研究和肝病治疗有重要意义。毕赤酵母表达系统做为真核重组蛋白表达体系,不仅胞外分泌的效率高,而且能够实现有效的翻译后加工和修饰,同时易于达到高密度培养,十分有利于获得更多的活性外源蛋白。
本论文主要研究优化了表达hALR的重组毕赤酵母在5L发酵罐的工艺条件。我们尝试了多种不同的甲醇流加策略对毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响,包括恒溶氧、恒比生长速率、恒甲醇浓度。通过不同甲醇流加策略的对比,我们发现恒定溶氧或恒定比生长速率的控制,会导致甲醇供给限制,而恒甲醇浓度导致溶氧限制,但溶氧限制的发酵结果优于甲醇限制。在溶氧限制情况下,控制恒定甲醇浓度,虽然整个表达阶段溶氧为零,但蛋白表达量显著高于控制恒溶氧或者恒比生长速率时蛋白表达量。同时在诱导表达阶段,有机氮源的添加对蛋白表达和降解没有明显效果,说明hALR的表达没有受到翻译的限制。为降低甲醇代谢引起的高耗氧,缓解溶氧的限制和影响,我们进一步尝试了诱导表达阶段的混合碳源流加,结果表明甘油和甲醇的混合流加抑制蛋白的表达,而乳酸和甲醇的混合流加未对蛋白表达产生阻遏,但由于没有细化流加方式,蛋白表达增强的效果不显著。而蛋白辅基核黄素的添加,可使发酵水平提高8％。
此外,我们考察了影响hALR蛋白表达量的其它因素(pH和温度),发现诱导阶段最佳的pH为6.0,当诱导温度从30℃降到25℃时,菌体在诱导阶段的比生长速率增大,蛋白hALR表达水平增加。基于以上工艺条件的优化,将发酵表达阶段的pH控制为6.0,甲醇浓度为6g/L,温度为25℃,诱导开始时添加核黄素,hALR的水平达到424mg/L。比初始工艺条件的发酵水平提高了93％。