论文部分内容阅读
自从日本琉球大学比嘉照夫教授于20世纪80年代初期研制出一种新型复合微生物菌剂－有效微生物群EM（Effective Microorganisms）以来，复合微生物的应用现已普及到全世界包括中国在内的60多个国家，并取得了显著的经济效益、社会效益和生态效益。多菌种混合发酵相对单菌种发酵有很多优势：提高生产效率和微生物生长速度，可利用营养成分比较单一的廉价的农副产品，并且还可以防至发酵污染。纤维素酶是一种复合酶，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖纤维二糖水解酶和纤维二糖酶的协同作用下才能水解成葡萄糖。目前，影响纤维素材料综合利用的关键问题纤维素酶的酶解效率不高，在纤维素利用过程中产生明显的产物（纤维二糖和葡萄糖）阻遏纤维素酶系的表达，直接影响纤维素酶系对纤维素材料的协同作用效率。为提高纤维素酶系的酶解效率，本文采用构建多菌种混合发酵体系发酵软化具有特殊结晶结构纤维素的稻壳，一方面通过体系中各菌种产酶情况调节纤维素酶系中各组分之间的协同作用，另一方面通过体系中的一些菌种及时利用纤维素酶解产物以解除底物和降解物对酶的影响。本文的主要研究内容和结果1、 根据纤维素酶系的组成特点及作用机制和微生物的生理特性筛选生长条件相似的多菌种组成发酵稻壳的复合微生物体系：根据绿色木霉纤维素酶系组分较全，但β－葡萄糖苷酶活力比较低，而黑曲霉的β－葡萄糖苷酶活力比较高的特点，选定绿色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316作为产纤维素酶的菌种来源，再根据啤酒酵母AS2.399、产朊假丝酵母1817和德氏乳杆菌都可利用还原单糖的特性，在以后的实验中将从这三种菌中筛选出最佳的第三种菌与前两种菌一起复合发酵以解除产物反馈抑制作用。2、 把绿色木霉、黑曲霉分别进行单菌种发酵，初步掌握各单菌发酵稻壳的最佳发酵条件，定出以下条件作为复合微生物发酵的参考：稻壳预处理的NaOH浓度2.0%、处理温度50℃（24h）、发酵pH5.0-5.5、发酵培养基含水量100%。3、 通过做对比实验从啤酒酵母AS2.399、产朊假丝酵母1817和德氏乳杆菌中筛选出最佳的第三种菌与绿色木霉和黑曲霉一起复合发酵以解除产物反馈抑制作用。结果发现，无论是FPA（filter paper enzyme activity）还是纤维降解率，啤酒酵母的效果最好，产朊假丝酵母次之，而德氏乳杆菌最差；且最高酶活基本上在发酵的第七天出现，而纤维降解率都是在第九天之后几乎没有什么变化。所以，本实验的复合微生物体系最终选定由啤酒酵母AS2.399、绿色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316构成。一方面参考绿色木霉和黑曲霉的单菌种发酵条件，一方面根据发酵需要重新设计十因素三水平的正交实验，结果得到复合微生物发酵稻壳的十个最佳条件如<WP=5>4、 下：稻壳预处理温度30℃，NaOH浓度3%，发酵温度30℃，黑曲霉接种时间0d(与绿色木霉同在第一天接种即与绿色木霉接种时间差为0d)，发酵pH4.5，啤酒酵母接种时间6d（比绿色木霉接种时间晚6d），培养基含水量80%，绿色木霉接种量为每20g干培养基中接入浓度为1×108cell/ml的孢子液2ml，黑曲霉接种量也为每20g干培养基中接入浓度为1×108cell/ml的孢子液2ml，啤酒酵母接种量为每20g干培养基中接入浓度为1×1010cell/ml菌液1ml。5、 在已确定的最优发酵条件下，设计实验优化发酵培养基的组成。由于涉及的因素比较多，仅采用正交设计各因素水平数就不能过多，而多水平实验对于优选培养基组成是必需的。所以采用正交设计和均匀设计相结合的方法对固态发酵培养基的无机盐及金属盐成分进行优化筛选，最后用微机对实验数据进行处理，得到两个回归方程，并由两方程分别得出预测极值点和最高FPA及纤维降解率的预测值，再综合考虑两方程的预测极值点和生产成本选出最优培养基配方为0.20%的土温80、0.10%(NH4)2SO4、0.20%（NH2）2CO和0.08%的KH2PO4,预测FPA为5.77U/g，纤维降解率32.38%。然后，进一步作实验对其进行验证，实验结果为FPA为5.64U/g，纤维降解率为28.05%，这与预测值基本相符，证明此优化培养基配方是有效的。6、 在最佳发酵条件下对最优配方的稻壳培养基进行发酵，把复合微生物发酵和单菌种发酵作对比实验。发现绿色木霉的最高酶活力发生在第5天，纤维降解率在第12天后几乎没什么变化，而黑曲霉最高酶活力却发生在第2天，纤维降解率在6天后没有变化，并且绿色木霉的酶活力比黑曲霉低。把黑曲霉和绿色木霉两种菌混合，最高FPA发生在第6天，纤维降解率在9天之后无变化，最高酶活比绿色木霉高，但比黑曲霉低，而纤维降解率比任一单菌高。当把绿色木霉和黑曲霉及酵母三种菌混合培养时，发现最高酶活力发生的时间延长到了第7天，但其酶活力仍比黑曲霉单菌种发酵以及黑曲霉与绿色木霉混合发酵的低，比绿色木霉单菌种发酵高，而纤维降解率则在10天后没有什么变化，且比两种单菌及其混合发酵都高。这主要是酵母菌的加入解除了产物的反馈抑制，从而大大提高了纤维降解率。通过此实验验证了本课题构建的由啤酒酵母AS2.399、绿色木霉AS3.3711和黑曲霉3.316组成的复合微生物体系在实际中的应用符合了我们最初的理论设计，三菌种在同一发酵体系中相互作用，对于固态发酵软化稻壳是非常?