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章鱼为传统的海洋药物,用作补益强壮药,能催乳、治疟疾等,目前认为具有消炎、活血、抗癌等作用。研究证明许多传统的海洋动物药的功效成分为多糖类,多糖具有抗肿瘤、增强免疫和抗衰老等活性。目前未见有章鱼相关药理,多糖和糖蛋白及其免疫活性的研究报道。本研究主要以南海产量较大的短腕类章鱼和弯斑蛸(Octopus dollfusi)为原料,提取分离和纯化章鱼多糖和糖蛋白,并对其免疫调节活性进行研究。
研究方法和内容包括:(1)原料成分分析;蛋白酶水解提取弯斑蛸不同组织的粗多糖;盐水煮提法提取糖蛋白。(2)用MTT法测定提取的多糖和糖蛋白对正常小鼠和免疫抑制小鼠脾细胞的增殖作用;通过免疫器官指数、白细胞计数等检测对正常和免疫抑制小鼠的免疫调节作用。(3)弯斑蛸肌肉多糖经DE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶层析进行纯化;用气相色谱测定纯化多糖的中性单糖组成,用红外光谱、凝胶渗透色谱、核磁共振等方法确定多糖的主要组成、纯度和结构等。(4)用MTT法测定弯斑蛸各级纯化多糖对脾细胞的增殖作用和对NK细胞的激活作用,用流式细胞仪检测对小鼠脾细胞CD4、CD8和CD25的影响,用ELISA法检测对小鼠脾细胞IL-2的诱生作用。
研究成果有:(1)章鱼内脏多糖含量高于可食部分(肌肉),总糖含量大小顺序为消化腺>生殖腺>肌肉;确定采用双酶同时水解法提取章鱼多糖,经化学法纯化也可达到较好的效果。(2)弯斑蛸肌肉多糖OG1、生殖腺多糖OG2和消化腺多糖(OG3)对正常小鼠免疫器官有增重作用,对CY和HC免疫抑制小鼠均有较好的治疗作用,提高白细胞数明显,对胸腺指数影响更为显著。(3)弯斑蛸肌肉多糖经柱层析得到3个级分POGⅠ、POG Ⅱ和POGⅠ-1,经分析其主要组成(或主链)为氨基己糖和葡萄糖醛酸组成的多糖。(4)POGⅠ-1为氨基半乳糖和葡萄糖醛酸组成的半乳糖胺葡萄糖醛酸多糖(Galactosaminoglucuroman),组成类似于硫酸软骨素类;POGⅠ-1主要单糖组成为半乳糖、岩藻糖和鼠李糖,硫酸基的含量较低,分子量(Mw)较低为9.8×103;1H-NMR和13C-NMR证实POGⅠ-1含有半乳糖胺和葡萄糖醛酸,主要在C6取代或连接。(5)纯化各级多糖对正常小鼠和免疫抑制小鼠脾细胞增殖均有促进作用,促进能力跟纯化程度呈一定的正相关关系,并在12.5-50 mg/L的低中剂量时效果更好;均能显著激活NK细胞活性,POGⅠ-1在低剂量(12.5μg/mL)时即有显著差异。(6)POGⅠ-1能提高免疫抑制小鼠脾细胞CD4/CD8比例,高剂量组效果较好;对培养的脾细胞中CD4+比例有较好的提高作用,跟对照组比增加了49.4%;对于培养脾细胞IL-2的诱生作用在培养时间较短时效果较好。研究可得出的结论有:(1)章鱼内脏多糖含量高,并跟肌肉多糖一样具有免疫活性;(2)章鱼多糖及章鱼糖蛋白均能促进T细胞的增殖,弯斑蛸多糖对CY和HC免疫抑制小鼠均有良好的疗效;(3)弯斑蛸肌肉多糖主要组成(或主链)为氨基己糖和葡萄糖醛酸组成的多糖,纯化的POGⅠ-1为氨基半乳糖和葡萄糖醛酸组成的半乳糖胺葡萄糖醛酸多糖,组成类似于硫酸软骨素类,分子量较低;(4)弯斑蛸各级纯化多糖能显著促进T细胞增殖和激活NK细胞活性,POG Ⅰ-1能提高脾细胞中CD4+比例和诱生IL-2。