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四环素类抗生素,作为一种广谱抗生素,广泛应用于人和动物细菌感染治疗,并且作为饲料添加剂促进动物生长。然而,四环素类抗生素的不合理使用导致全球范围内四环素抗性菌及抗性基因的严重污染,引起了世界范围内的广泛关注。污水处理厂是四环素抗性菌和抗性基因的重要污染源,废水中的四环素诱导微生物产生抗性,并且通过基因水平转移使其他微生物获得四环素抗性,对人类健康和生态环境安全造成严重威胁。因此,研究和分析污水处理系统中四环素抗性菌的抗生素抗性等生理特性,将对四环素抗性菌的环境风险控制产生积极意义。 本研究从上海市某城市污水处理厂活性污泥中富集、筛选、分离出5株对四环素具有一定抗性的菌株,选取其中一株具有较强抗性的菌株,命名为HT-1,进一步考查其相关生长和抗生素抗性等特性。依据菌株的形态特征、生理生化特性和16S rDNA测序结果,鉴定菌株HT-1为无色杆菌属(Achromobacter sp.)。通过正交实验,得出菌株HT-1最佳生长条件为pH=9.0,35℃,转速为200 r·min-1,盐度为0。 为了解四环素抗性菌HT-1抗性蛋白及其编码基因的同源性,本研究对菌株HT-1的抗性蛋白进行了同源性分析,并对其编码基因进行了基因簇同线性分析。同源性分析表明,菌株HT-1中的四环素外排泵蛋白、β-内酰胺酶、青霉素结合蛋白、青霉素酰化酶与无色杆菌属中多数菌株的相应功能酶有较好的同源性,且与Achromobacterxylosoxidans的同源性最好。全基因组分析结果表明,菌株HT-1含有四环素、β-内酰胺类、青霉素等多种抗生素抗性基因。对比无色杆菌属抗性基因的基因簇分析结果表明,这些抗性基因在无色杆菌属中具有普遍存在性。 通过KEGG对菌株HT-1蛋白质组的功能注释,结合菌株HT-1苯甲酸、氯烷烃和氯烯烃降解通路,推测其降解通路的关键酶分别为邻苯二酚1,2-双加氧酶(EC:1.13.11.1)、邻苯二酚2,3-双加氧酶(EC:1.13.11.2)和卤乙酸脱卤素酶(EC:3.8.1.2和EC:3.8.1.3)。对这三种酶的同源性和基因簇进一步分析,同源性分析表明,这三种酶与Achromobacter xylosoxidans具有较高的同源性;同时,基因簇同线性分析表明,这些功能基因与其它无色杆菌属菌株的基因簇有较高的同线性,菌株HT-1苯甲酸、氯烷烃和氯烯烃代谢通路中功能酶的编码基因在无色杆菌属中具有普遍存在性。 在前期研究基础上,进一步开展了活性污泥体系中四环素浓度对菌株HT-1中抗性基因的影响特性研究。结果表明,500μg·L-1四环素显著提高菌株HT-1中四环素抗性基因的丰度,0.4μg·L-1四环素能降低菌株HT-1中β-内酰胺抗性基因和青霉素抗性基因的丰度。活性污泥则降低无色杆菌属菌株四环素抗性基因的丰度,并且在一定程度上提高其它非四环素抗性基因如β-内酰胺抗性基因、青霉素抗性基因的丰度。 研究初步揭示了污水处理系统中四环素抗性菌的抗生素抗性及其抗性基因的同源性,鉴于无色杆菌属是潜在的病原性微生物,该结论可为废水生物处理系统中含抗生素抗性基因致病微生物的环境行为和风险提供参考。