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附睾是精子成熟和储存的场所，也是男性避孕的理想靶器官。深入研究附睾特异表达的基因有助于揭示精子在附睾中成熟的分子机制，为临床男性不育的诊断治疗以及男性避孕药开发提供适当的靶点，取得原创的自主知识产权。在精子成熟过程中许多精子蛋白发生酶解加工，蛋白酶和蛋白酶抑制剂的平衡起很重要的作用。Kazal型的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPINK)一般是由一个或多个重复保守Kazal结构域所组成，在自然界广泛存在，如鸟蛋、昆虫、小龙虾、哺乳动物组织和体液中。它们与血凝、纤维蛋白溶解、胚胎发生、个体发育、食物消化、炎症和免疫应答等有着密切关联，现在越来越多的生物体中发现新型的SPINK基因并且在逐步地应用于临床治疗。SPINK13是近期克隆得到的附睾特异的KAZAL型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPINK)家族的新成员。本文主要是在已克隆到的恒河猴的SPINK13的基础上克隆了其在大鼠的同源物并对其生物学功能进行了初步研究。大鼠的Spink13基因定位于染色体18q12.1上，与其他SPINK家族相邻，其5个外显子编码97个氨基酸，N端26个氨基酸残基为信号肽。氨基酸组成上具有SPINK家族的典型结构域。Northern blot和Western Blot以及免疫组化的结果表明spink13特异性地在附睾中表达，尤其是在附睾起始部位，在睾丸输出小管末梢也有少量表达。Spink13在整个生育期都有较高的表达且受雄激素调控。从附睾起始区、头部、体部和尾部的精子中均可检测到Spink13的存在，间接免疫荧光的结果表明Spink13信号集中在精子头表面。在附睾起始区，Spink13主要结合在精子头部背侧，在附睾头，体部信号与顶体Marker花生凝集素(leetin PNA)有部分重叠，而附睾尾部的Spink13信号与精子顶体Marker完全重合。这表明Spink13从附睾起始段的上皮细胞合成并分泌到管腔中，并结合在精子头部区域，而随着精子在附睾中转运的过程中Spink13发生移位，到附睾尾部Spink13蛋白完全结合在精子的顶体区域。经Western Blot检测附睾起始区、头、体、尾部的精子蛋白分级抽提物，Spink13位于附睾起始区精子的高盐和去垢剂提取物组分，而在附睾头、体、尾的精子均位于SDS组分，这表明在附睾的转运过程中，Spink13与精子的结合逐步增强并发生移位。精子与Spink13单抗共孵育后，经Ca离子载体A23187体外诱导顶体反应率升高而精子运动力以及蛋白酪氨酸磷酸化水平没有变化。体外受精(IVF)结果显示Spink13单抗可抑制大鼠体外精卵结合，并且这种抑制效果是剂量依赖性的。随后，我们用基于慢病毒载体的RNAi方法于大鼠附睾内下调了Spink13的表达并对精子表型进行分析。当附睾体内Spmk13的表达水平下调60％左右，附睾尾部精子结合的Spink13蛋白也明显减少，表达下调后精子的运动参数以及酪氨酸磷酸化水平并没有明显变化，但是雄鼠生育能力明显下降。表达下调后精子自发顶体反应率升高，并且经Ca离子载体A23187体外诱导项体反应率也有所升高。同时，IVF实验表明附睾尾部精子体外受精力下降。体外实验以及整体RNAi实验表明Spink13能够调控顶体的完整性，保证获能后的精子只有在和卵透明带相互识别时才能发生顶体反应，从而调控精子的成熟。