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[目的]miR-146b-5p是胶质瘤的抑癌miRNA(TumoursuppressingmiRNA，TS-miRNA)。浸润性生长是胶质瘤的突出特征，也是导致其手术不易全切、术后复发率高及预后不良的主要原因。已知基质金属蛋白酶16(Martrixmetalloproteinase16，MMP16)过表达与多种颅外恶性肿瘤的浸润性生长密切相关。生物信息学预测提示MMP16可能是miR-146b-5p的天然靶基因。然而，不同级别胶质瘤细胞中miR-146b-5p及MMP16的表达有无差异，二者表达变化的相互关系及其在胶质瘤发生、发展中有何作用，miR-146b-5p对胶质瘤细胞侵袭、迁移和凋亡有何影响及其分子机制，均尚不清楚。本研究旨在对上述问题进行深入系统的探讨。
[研究方法](1)利用锁定寡核苷酸探针原位杂交和免疫组织化学方法分别检测了10例人非肿瘤对照脑组织和60例不同级别胶质瘤组织中miR-146b-5p和MMP16的表达状况。(2)采用荧光素酶实验、qRT-PCR及Westernblot验证MMP16是否是miR-146b-5p的靶基因，进一步研究miR-146b-5p下调MMP16表达的机制。(3)经表达质粒转染和G418筛选建立稳定过表达miR-146b-5p的人胶质母细胞瘤细胞系(U87MG、SNB19、TJ905)的亚细胞系及它们的对照亚细胞系，采用stem-loopqRT-PCR、普通qRT-PCR和Westernblot分别检测各亚细胞系miR-146b-5p、MMP16mRNA和MMP16蛋白的表达水平。(4)采用Westernblot和明胶酶谱检测验证上调miR-146b-5p表达是否能抑制MMP16的表达和阻断MMP2酶原激活。(5)利用体外侵袭迁移实验和Matrigel3D培养来比较miR-146b-5p过表达亚细胞系和相应对照亚细胞系的侵袭迁移能力;用靶向MMP16的特异性siRNA阻断MMP16表达，进一步验证miR-146b-5p是否是通过下调MMP16表达抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。(6)通过流式细胞术(FCM)和碱性单细胞电泳实验(SCGE)来评价各亚细胞系的细胞凋亡水平。(7)通过流式细胞术(FCM)检测各亚细胞系细胞周期分布情况。
[研究结果](1)原位杂交结果显示，WHOⅠ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组的miR-146b-5p阳性标记指数(LI％)分别为13.34±0.14、8.60±0.17、2.90±1.26，并均明显低于非肿瘤对照脑组织的LI％（34.23±1.58，P＜0.0001）;miR-146b-5p表达水平随着胶质瘤良恶性级别的升高相应降低，除Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅲ级组外，其余各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.001）。而MMP16表达水平则呈相反趋势，对照脑组织的MMP16LI％最低（0.40±0.55），且其表达水平随胶质瘤良恶性级别增加相应升高(WHOⅠ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组分别为25.99±1.24、30.99±1.30、64.37±6.26);除Ⅰ～Ⅱ组与Ⅲ组之间外，其余各组间的差异均有统计学意义（P＜0.0001）。经直线相关分析证实，以上两种指标之间呈显著性负相关(r=-0.634,P＜0.0001)。(2)荧光素酶实验结果显示，在胶质瘤细胞里，miR-146b-5p可通过与野生型MMP16mRNA的3UTR特异性结合，介导其对荧光素酶报导基因表达的沉默作用;因miR-146b-5p不能与突变型MMP16mRNA的3UTR结合，当用二者共转染胶质瘤细胞时不能沉默荧光素酶报导基因的表达;从而证实MMP16是miR-146b-5p的天然靶基因。(3)与相应的对照亚细胞系相比，miR-146b-5p过表达亚细胞系的miR-146b-5p表达水平明显升高，而MMP16mRNA及蛋白表达水平均明显降低，说明miR-146b-5p可以通过直接降解MMP16mRNA阻断MMP16表达。(4)miR-146b-5p不影响pro-MMP2的表达，而是通过抑制MMP16的表达阻断细胞外pro-MMP2的激活过程。(5)过表达miR-146b-5p可通过上述机制有效的抑制胶质瘤绌胞迁移和侵袭，而MMP16特异性小干扰RNA可以部分的模拟miR-146b-5p对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用，表明miR-146b-5p/MMP16/MMP2通路在miR-146b-5p介导的胶质瘤细胞迁移和侵袭抑制效应中发挥重要作用。(6)流式细胞术及碱性单细胞电泳实验结果显示，miR-146b-5p过表达亚细胞系的凋亡指数(AI％)明显高于对照亚细胞系，但是细胞周期分布无明显改变，提示miR-146b-5p可诱导胶质瘤细胞凋亡而不抑制其增殖。
[结论]
(1)随着胶质瘤恶性度的升高，miR-146b-5p表达水平降低，而MMP16表达水平增加，二者呈显著负相关，miR-146b-5p和MMP16表达水平可作为评价胶质瘤生物学行为及患者预后的重要参考指标。
(2)本研究建立的miR-146b-5p过表达亚细胞系可稳定高表达miR-146b-5p，是研究miR-146b-5p抑瘤效应的理想细胞模型。
(3)在胶质瘤细胞中，MMP16是miR-146b-5p的天然靶基因，miR-146b-5p通过直接降解其mRNA来下调MMP16蛋白表达。
(4)miR-146b-5p不影响pro-MMP2的表达，而是通过抑制MMP16的表达阻断细胞外pro-MMP2激活过程，进而有效的抑制胶质瘤细胞侵袭。
(5)miR-146b-5p对胶质瘤细胞的增殖和细胞周期分布无影响;但可显著抑制胶质瘤细胞的迁移和诱导其凋亡，但后两种调控作用的分子机制尚不清楚，还有待于进一步探讨。
(6)miR-146b-5p表达异常减少是导致胶质瘤发生、发展的重要因素，补充外源性miR-146b-5p可逆转上述异常并发挥有效的抑瘤作用，故其作为一种多功能抑瘤因子，在恶性胶质瘤基因治疗方面有重要的实用价值。