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茴香霉素是1954年由辉瑞公司在Streptomyces roseochromogenes和Streptomyces griseolus发酵液中分离到的抗生素,能特异结合在60S核糖体亚基上阻断肽键的形成,从而显示多种优良的生物和药理活性(包括抗病原虫、抗真菌、抗癌、免疫抑制和消弱创伤记忆等活性)。作为农用抗生素-农抗120的主要活性成分,已经大量用于农作物真菌病害的防治,是目前在中国得到广泛应用的重要农用抗生素。由于茴香霉素结构独特且活性多样,科学家们长期以来对它表现出浓厚的研究兴趣,已有近30种化学合成方法被报道,但其生物合成基因簇及生物合成机理一直不清楚。本研究以生物活性为导向的高通量筛选技术,克隆到茴香霉素生物合成基因簇。通过构建22个单基因缺失突变株,确定了8个茴香霉素生物合成的必需基因,分别是调控基因aniF、甲基转移酶基因aniK、乙酰转移酶基因aniI、转运蛋白基因aniL、氨基转移酶基因aniQ、转酮酶基因aniP、糖基转移酶基因aniO和短链脱氢酶基因aniN。通过体外生化实验,发现α-糖苷水解酶基因aniG也是茴香霉素生物合成必需的,因此,确定茴香霉素生物合成基因簇包含aniF、aniG、aniI、aniK、aniL、aniN、aniO、aniP和aniQ 9个基因。结合HPLC、Q-TOF和NMR技术,鉴定了6个茴香霉素生物合成中间产物的结构。利用体外生化实验鉴定了脱氢酶AniN具备氧化和还原双功能,可介导茴香霉素中吡咯烷的生成,提出了AniN的催化机制模型,丰富了对天然产物中吡咯环生物合成的理解和认识;鉴定了氨基转移酶AniQ可催化去氨基与再次氨基化两步不同的转氨反应,并且两次转氨反应识别的底物在结构和极性方面差异很大,不同于其它的氨基转移酶;揭示了糖基转移酶AniO可催化隐藏的糖基化反应,这是首次在天然产物生物合成过程中发现隐藏糖基化的现象,这步隐藏反应对下游酶AniN和AniQ的催化效率有重要影响;证实了α-糖苷水解酶AniG和甲基转移酶AniK分别负责糖基水解和甲基化反应。另外,通过同位素喂养实验鉴定了转酮酶AniP负责催化4-羟基苯丙酮酸与磷酸甘油醛的缩合反应。总之,本研究克隆了茴香霉素生物合成基因簇,提出了完整的茴香霉素生物合成途径,发现的氨基转移酶AniQ、转酮酶AniP、糖基转移酶AniO和短链脱氢酶AniN 4个酶负责催化茴香霉素中吡咯烷的形成,完全不同于其它已报道的吡咯烷生物碱的生物合成方式。鉴定的隐藏糖基化反应是在天然产物生物合成中首次发现,拓展了对天然产物生物合成中糖基化反应的理解和认识。本研究为阐明茴香霉素生物合成机理奠定了坚实的基础,基于生物合成指导的结构和活性改造研究,也将有力推动茴香霉素作为活性组分的农抗120的实际应用。