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研究背景：结直肠癌（Colorectal carcinoma, CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一,全球CRC的发病率均呈上升趋势。CRC的发生发展过程与众多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变有关。miRNA是一类内源性的非编码单链RNA,由22个左右核苷酸组成,其靶向抑制mRNA的翻译或直接将其降解,使靶基因在转录后水平的表达受到抑制,从而起到基因表达的调控作用。2003年,Michael等最早报道了miRNA在人结直肠癌组织和正常结直肠黏膜中的差异表达,检测到28种miRNAs表达发生了变化,其中miR-143和miR-145在癌组织中表达较正常组织明显降低。随后的研究发现众多miRNA参与了CRC的发生发展过程,并与CRC的诊断、分期、治疗与预后等密切相关。miRNA通过调控不同的靶基因在肿瘤中起到类似于原癌基因或抑癌基因的作用。miR-133b最初被认为是一种心肌特异性的miRNA,在心肌的发育和功能维持方面起重要作用。近年有研究小组几乎同时发现miR-133b在肺癌、食道癌、舌癌、胃癌、膀胱癌等不同肿瘤中表达失调,并具有明确的肿瘤抑制效应。胡桂等首次通过研究证实了miR-133b在结直肠癌组织及细胞系中的表达明显下调,且与结直肠癌细胞的恶性程度密切相关；功能实验进一步证实miR-133b可抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移,并具有明显的细胞周期阻滞的作用；动物实验发现在裸鼠体内同样有明确的肿瘤抑制作用。尽管如此,miR-133b在CRC中的作用机制仍不明确,需进行进一步研究。研究目的：本实验在前期实验的基础上,通过细胞转染建立miR-133b高表达的结直肠癌细胞系,并与未转染的结直肠癌细胞对比进行基因芯片高通量测序及基因的功能注释,筛选出miR-133b在CRC中可能相关的靶基因。材料与方法：本研究选用两种购白ATCC细胞库的结直肠癌细胞系SW620及HT29,将细胞分成4组进行细胞转染。实验分组为miR-133b mimics转染组（用Lipofectamine2000即Lipo2000转染miR-133b mimics）,NC转染组（用Lipo2000转染miR negative control）,空白组（Blank,加入与前2组等量的Lipo2000,无niRNA片段）,对照组（Control,细胞常规培养,不加入Lipo2000和miRNA片段）。将转染后细胞进行倒置荧光显微镜下的荧光显色情况观察,并采用real-time PCR的方式检测各组细胞中miR-133b的表达情况,评价其转染效率。将成功转染了miR-133b mimics的两种细胞分别与相应细胞的NC转染组配对进行Agilent人全基因表达谱芯片的高通量测序。检测出的差异基因初步根据基因在miR-133b组中表达下调、P<0.05、FC （abs）≥1.5这几个条件进行筛选,然后进一步与miRNA靶基因预测软件（miRBase, PicTar, TargetScan）进行比对,最终筛选出的基因行GO分子功能和Pathway信号通路富集度统计分析。结果：1.转染结直肠癌细胞系后miR-133b表达的检测miR-133b mimics转染CRC细胞系SW620及HT29的最佳浓度为80nM,转染效率可达50%左右。通过Real-time PCR法检测miR-133bmimics转染组,NC转染组,空白组及对照组中miR-133b的相对表达率（RQ）。以对照组中miR-133b相对表达率为1,以RQ=2-△△CT为公式计算其他各组的RQ值,在SW620细胞系中,miR-133b mimics转染组miR-133b的表达（502.461±16.837）显著上调（P=0.000563）;NC转染组miR-133b的表达（0.841±0.305）无明显改变（P=0.537648）；空白组miR-133b的表达（0.803±0.284）无明显改变（P=0.431831）；NC转染组与空白组比较miR-133b的表达无明显差异（P=0.910242）。在HT29细胞系中,miR-133b mimics转染组miR-133b的表达（332.386±13.039）显著上调（P=0.000773）；NC转染组miR-133b的表达（0.870±0.219）无明显改变（P=0.490357）;空白组miR-133b的表达（0.767±0.356）无明显改变（P=0.451923）；NC转染组与空白组比较miR-133b的表达无明显差异（P=0.807844）。2.人全基因表达谱筛选靶基因的分析运用Agilent人全基因表达谱芯片标记出的差异基因数,SW620细胞系为34364个,HT29细胞系为39443个。符合在miR-133b组中表达下调、P<0.05.FC（abs）≥1.5这几个标准的差异基因数,SW620细胞系有346个,HT29细胞系有354个。运用三种不同的microRNA靶点预测软件（miRBase, PicTar, TargetScan）最终筛选出9个相关靶基因,SW620细胞系有7个靶基因：latent transforming growth factor beta binding protein1（NM206943）, contactin associated protein1（NM003632）, human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein2（NM006734）, dual specificity phosphatase5（NM004419） connective tissue growth factor （NM001901）, yippee-like2（Drosophila）（NM001005404）,GABA（A） receptor-associated protein like1（NM031412）。 HT29细胞系有2个靶基因：family with sequence similarity19（chemokine （C-C motif）-like）, member A5（NM015381）, beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase1（globoside blood group）（NM001038628）。将以上9个靶基因经分子功能注释系统（Molecule Annotation System,MAS3.0）进行相应的GO分子功能和Pathway信号通路富集度统计分析。B3GALNT1主要定位在高尔基体膜上,与镁离子结合有关,参与部分糖蛋白的代谢过程,并有转移酶活性。CNTNAP1主要定位于细胞膜上,为一种细胞粘附分子,有受体活性,有信号传导功能,并与SH2/SH3结合有关。CTGF主要定位于细胞膜上或细胞间质中,是一种生长因子,与整合素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等信号通路有关,还与细胞形态、运动、粘附、迁移、分化,表皮生长,组织形成,血管生成,骨化、软骨缩合等多种生物学过程有关。DUSP5定位于细胞核,主要参与氨基酸去磷酸化,还有酪氨酸磷酸酶、MAPK磷酸酶、水解酶等活性,并与MAPK信号通路有关。GABARAPL1在细胞内各处均存在,能调节自噬作用,与蛋白结合,如GABA受体、β-微管蛋白等。HIVEP2主要定位于细胞核上,与DNA连接,金属离子的结合有关,调控转录过程。LTBP1定位于细胞间质、细胞质和细胞核上,与钙离子、生长因子等结合有关,有TGF-β受体活性,并参与其信号通路。FAM19A5主要定位于细胞间质或者细胞膜上,YPEL2主要定位于细胞核上。结论：1.miR-133b mimics可成功转染于结直肠癌细胞系SW620及HT29,且在这两种细胞系中高表达。2.经过基因芯片及靶基因预测软件筛选出miR-133b相关的9个靶基因,分别为B3GALNT1、 CNTNAP1、CTGF、DUSP5、GABARAPL1、HIVEP2、LTBP1、 FAM19A5及YPEL2,通过功能注释后发现其中有部分基因功能可能参与了结直肠癌的发生发展、侵袭转移等重要过程。