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研究背景侵袭转移是恶性肿瘤主要的生物学特性之一,也是90%肿瘤患者死亡的主要原因,肿瘤的转移是细胞与细胞基质之间相互作用的复杂的多步骤过程。近年来,肺恶性肿瘤的发病率和死亡率显著上升,已成为我国第一大癌症,肺癌患者术后的复发转移是其病死率居高不下的主要原因。Twist为碱性螺旋-环-螺(bHLH)蛋白家族转录因子之一,能促使正常表皮细胞向间质化的改变,使细胞获得运动能力。研究表明Twist存在于恶性肿瘤的转移过程中,其表达的上调能促进肿瘤细胞的侵袭转移。上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤的侵袭转移密切相关,通过 EMT,上皮细胞失去其细胞间的连接和细胞的极性,使其细胞骨架形态发生重塑失去上皮表型,最终获得迁移和侵袭能力。Twist可以直接诱导EMT,也可间接地影响EMT转录因子促进肿瘤侵袭转移。丹参酮是源于活血化疲类中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)及丹参同科目植被的脂溶性产物,包含丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ等多种元素。丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)是丹参酮ⅡA经磺化反应后形成的一种水溶性钠盐,大大提高了丹参酮ⅡA的水溶性,是临床常用的活血化瘀类注射剂。顺铂(DDP)是治疗肺恶性肿瘤的常用化疗药物,可诱导癌细胞凋亡,引发DNA损伤反应,但是DNA的修复功能导致的顺铂耐药成为肿瘤患者化疗无效的主要原因之一。恶性肿瘤患者的血液呈高凝状态,中医辨证多为血瘀证类型。活血化瘀药丹参酮ⅡA能有效改善血瘀证,具有较好的抑制肿瘤转移作用,其与化疗药联合使用可中西结合提高临床疗效,改善患者预后,但具体机制尚不清楚。近几年研究表明,促癌基因Twist上调引起EMT发生在肿瘤细胞的侵袭转移中起到至关重要的作用。本实验将从从Twist表达角度探讨STS、DDP及STS联合DDP对Lewis肺癌细胞EMT发生的影响。研究目的本研究通过对STS及STS联合DDP对Lewis肺癌细胞形态、抑制率影响、Twist及EMT相关分子E-caherin、N-cadherin的表达,进一步探讨活血化瘀中药STS对lewis肺癌细胞体外侵袭转移的影响,为临床应用STS及其联合DDP用药提供实验依据和科学内涵,为活血化瘀类中药的进一步应用奠定基础。研究方法实验一 STS联合DDP对Lewis肺癌细胞的形态及抑制率影响:培养Lewis细胞并药物干预。实验分8组:①阴性对照组;②阳性对照组(DDP);③STS低浓度组;④STS中浓度组;⑤STS高浓度组;⑥STS+DDP低剂量组;⑦STS+DDP中剂量组;⑧STS+DDP高剂量组。指标检测:①倒置显微镜观察细胞形态;②CCK-8法检测细胞抑制率。实验二STS联合DDP对Lewis肺癌细胞黏附及侵袭转移能力影响:培养Lewis细胞、包被transwell小室、小室内接种细胞。包被96孔板、接种细胞、MTT比色法检测光吸收值A。实验分8组:①阴性对照组;②阳性对照组(DDP);③STS低浓度组;④STS中浓度组;⑤STS高浓度组;⑥STS+DDP低剂量组;⑦STS+DDP中剂量组;⑧STS+DDP高剂量组。指标检测:①各组细胞的Matrigel、FN黏附率;②穿越至Transwell下室细胞数。实验三ELISA法检测STS联合DDP对Lewis肺癌细胞Twist和E-cadherin表达浓度影响:培养Lewis肺癌细胞并药物干预、收集各组细胞上清、购买ELISA试剂盒检测各组浓度。实验分8组:①阴性对照组;②阳性对照组(DDP);③STS低浓度组;④STS中浓度组;⑤STS高浓度组;⑥STS+DDP低剂量组;⑦STS+DDP中剂量组;⑧STS+DDP高剂量组。指标检测:①各组细胞上清的Twist表达浓度(pg/ml);②各组细胞上清的E-cadherin 表达浓度(pg/ml)。实验四Weston-blot法检测STS联合DDP对Lewis肺癌细胞Twist、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达情况:培养Lewis肺癌细胞并药物干预、提取各组细胞总蛋白、BCA法蛋白定量、SDS-PAGE凝胶电泳。实验分8组:①阴性对照组;②阳性对照组(DDP);③STS低浓度组;④STS中浓度组;⑤STS高浓度组;⑥STS+DDP低剂量组;⑦STS+DDP中剂量组;⑧STS+DDP高剂量组。指标检测:①各组细胞Twist蛋白表达量;②各组细胞E-cadherin蛋白表达量;③各组细胞N-cadherin蛋白表达量。实验五RT-PCR法检测STS联合DDP对Lewis肺癌细胞Twist、E-cadherin、N-cadherin mRNA的表达影响:培养Lewis肺癌细胞并药物干预、总RNA提取、cDNA合成、PCR扩增。实验分8组:①阴性对照组;②阳性对照组(DDP);③STS低浓度组;④STS中浓度组;⑤STS高浓度组;⑥STS+DDP低剂量组;⑦STS+DDP中剂量组;⑧STS+DDP高剂量组。指标检测:①RT-PCR检测各组TwistmRNA相对表达量;②RT-PCR检测各组E-cadherinmRNA相对表达量;③RT-PCR检测各组TwistN-cadherinmRNA相对表达量。研究结果实验一结果:①随着药物浓度增加,细胞形状逐渐由梭形变为圆形或不规则形态,由贴壁状态逐渐呈悬浮状态;②细胞的荧光亮度随着浓度增加逐渐变弱,即死亡细胞数量增多;③与阴性对照组相比,STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组24h细胞抑制率显著性差异(p=0.0007),且呈浓度依赖性增加;④与阴性对照组相比,STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组36h细胞抑制率显著性差异(p=0.0009),且呈浓度依赖性增高;⑤与阴性对照组相比,STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组细胞48h抑制率呈显著性差异(p=0.009),整体抑制率均高,无浓度依赖性。实验二结果:①与阴性对照组相比,STS低剂量组、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组Matrigel黏附率呈显著性差异(p=0.001),且呈浓度依赖性降低;②与阴性对照组相比,STS高剂量组、STS+DDP高剂量组FN黏附率呈显著性差异(p=0.01),且呈浓度依赖性降低;③与阴性对照组相比,STS低剂量组、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组侵袭转移至Transwell小室下室的细胞数呈显著性差异(p=0.000),且呈浓度依赖性降低。实验三结果:①与阴性对照组相比,STS低剂量组、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组Twist表达的浓度呈显著性差异(p<0.01),且呈浓度依赖性降低。②与阴性对照组相比,STS高剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组E-cadherin表达的浓度呈显著性差异(p<0.01),且蛋白表达浓度呈浓度依赖性增高。实验四结果:Weston-blot结果显示:①与阴性对照组相比,STS低剂量组、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组Twist蛋白表达有显著性差异(p<0.01),高剂量组表达量显著降低,但无浓度依赖性;②与阴性对照组相比,STS高剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组E-cadherin蛋白有显著性差异(p<0.01),且蛋白表达水平呈浓度依赖性增高;③与阴性对照组相比,STS中剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组N-cadherin蛋白有显著性差异(p<0.01),且STS+DDP组随着浓度增高而降低。实验五结果:RT-PCR结果显示:①与阴性对照组相比,STS低剂量组比较、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组Twist mRNA有显著性差异(p<0.01),且其相对表达量随着浓度增高依次降低;②与阴性对照组相比,STS高剂量组、STS+DDP高剂量组E-cadherinmRNA有显著性差异(p<0.01),且相对表达量较低浓度组显著增高;③与阴性对照组相比,STS低剂量组比较、STS中剂量组、STS高剂量组、STS+DDP低剂量组、STS+DDP中剂量组、STS+DDP高剂量组N-cadherinmRNA有显著性差异(p<0.01),且STS+DDP组随着浓度增高而降低。结论1.中药STS和DDP可分别抑制Lewis肺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡,STS高剂量组效果优于DDP;STS联合DDP作用最显著。2.中药STS和DDP及两者联合可分别降低Lewis肺癌细胞与胞外基底膜及FN的黏附率,STS作用最显著。3.STS和DDP及两者联合可分别下调促癌基因Twist及N-cadherin的表达、上调E-cadherin的表达,抑制Lewis肺癌细胞EMT发生,避免其向远处的侵袭转移;STS联合DDP作用最显著。