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细胞周期是细胞生命活动的基本过程。在进化过程中,细胞建立并发展了一系列的调控机制,以确保细胞周期严格有序地交替和各个时相依次有序变更。多种细胞周期蛋白在调控细胞周期各个时相转换中发挥作用,其主要包括：细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)家族蛋白、细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKIs)。细胞通过对三类细胞周期蛋白的合成、降解以及翻译后修饰等环节进行调控,从而保证细胞周期正常的进行。泛素依赖的蛋白质降解是细胞调控蛋白质活性的一个基本机制,在细胞周期调控中起重要的作用,几乎所有细胞周期蛋白的降解都依赖于该过程。CUL4B属于cullin蛋白家族,该家族成员是泛素依赖降解系统中E3连接酶的成员,在本实验室发现的CUL4B突变导致精神发育迟滞的家系中,女性携带者出现X染色体失活偏倚,患者骨骼发育异常以及CUL4B低表达的细胞出现S期停滞提示CUL4B可能在细胞周期调控中发挥重要的作用。然而,目前对于CUL4B在细胞周期调控方面的研究还比较少,仅发现少数几种与细胞周期调控相关的靶蛋白(如Cyclin E、CDT1和p21),因此寻找CUL4B在细胞周期调控过程中的蛋白对研究CUL4B在细胞周期调控中的生物学功能至关重要。首先,我们提取稳筛的CUL4B低表达非同步化的HeLa和HEK293细胞及其对照细胞的总蛋白,利用western blotting分析方法对p21、p27、p53、CDT1、CDC6、cyclin D1、CHK1、E2F1、CDC25A、CDC25C和CDK2等细胞周期调控相关蛋白的表达进行检测,结果发现这些蛋白的表达在实验组和对照组没有显著的差异。随后我们通过向培养基中加入细胞周期阻断药物的方法将CUL4B低表达的HeLa和HEK293细胞及其对照细胞分别同步化至G1期、S期、G2/M期,并使用流式细胞术对同步化效果进行监控。确定合适的处理方法后,我们提取同步化至不同时期的CUL4B低表达HeLa和HEK293细胞及其对照细胞的总蛋白,同样使用western blotting分析检测上述蛋白的表达情况,结果发现与对照细胞相比,CUL4B低表达的HeLa细胞内p53、p27和CHK1蛋白在S期有明显的积累。然而在CUL4B低表达的HEK293细胞中p53在G1/S期积累,CHK1在S期积累,p27没有明显的变化。为了明确导致CUL4B低表达HeLa细胞内p27、p53和CHK1蛋白积累的分子机制,我们又检测了上述基因在S期时的mRNA的表达水平,结果发现CUL4B低表达的细胞中上述基因的mRNA水平与对照细胞相比并没有明显的差异,提示这些蛋白在S期内CUL4B低表达HeLa细胞中的表达上调是在转录后水平而非转录水平。对这几种蛋白半衰期的测定发现在CUL4B低表达的HeLa细胞中p27和CHK1的半衰期明显延长,表明CUL4B的表达下调导致这两种蛋白的降解发生障碍。随后我们发现外源性CUL4B的表达能够减轻因内源性CUL4B表达下调而造成的p27、p53和CHK1的积累。以上实验结果提示,CUL4B在p27、p53和CHK1的降解中发挥重要的调控作用。综上所述,我们建立了针对本实验室条件下所用细胞(HeLa和HEK293)的细胞周期同步化方法,并在此基础上寻找到CUL4B在细胞周期调控中的候选靶蛋白。这些实验结果为进一步研究CUL4B在细胞周期调控中的功能奠定了基础。