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循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell, CTC)是由原发或转移病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞,其作为一种实时“液体活检”手段反映了肿瘤是否发生侵袭转移。肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中的研究均提示,肿瘤诊断初期检测到CTC是疾病不良预后的独立预测因素,CTC检测阳性患者的无进展生存期和总生存期均明显短于CTC检测阴性的患者；而在有效地放化疗、激素治疗或靶向抑制剂治疗后CTC数目明显下降,提示CTC可用于监测辅助放化疗的疗效。同时,CTC中除含有类似于原发组织的遗传物质外,在播散过程中还会获得其他的额外遗传信息,因而,CTC分子水平变化可以为个体化疾病诊疗提供依据,CTC的分子基因分析有望监测疾病治疗过程中肿瘤基因型变化,如EGFR酪氨酸激酶TKIs治疗过程中耐药基因T790M突变出现,从而为非小细胞肺癌病人药物调整提供依据。总之,检测肿瘤患者外周血中的CTC具有十分重要的意义。但是,相比较外周血中存在的大量白细胞,CTC仅为外周血中的稀有细胞,这就对其检测分析的方法提出了很高的要求,为了尽可能反应外周血中CTC的情况,目前CTC检测一般分为两个连续的步骤：分离和鉴定。其中又以依赖肿瘤细胞表面上皮特异性粘附分子(EpCAM)表达而富集和鉴定CTC的方法为多,如美国食品药监局审批通过的CellSeach系统。但是,随着研究的深入,人们发现,CTC从原发病灶脱落进入外周血的过程中会发生上皮间质转化(EMT),上皮特异性抗原表达弱化或者消失。循环肿瘤细胞的异质性使得传统的依赖上皮特异性抗原表达来鉴定CTC的方法应用受到限制,只能检测到EpCAM阳性的细胞,而无法检测EpCAM阴性的细胞。因此,我们旨在建立一种不依赖EpCAM的CTC分离和鉴定方法,以期提高实体瘤CTC的检出率,同时对单个CTC肿瘤细胞进行基因分子突变检测。本研究第一部分在优化免疫磁珠包被CD45抗体差减富集CTC的基础上,通过引入不依赖EpCAM表达的荧光原位杂交(FISH)8号染色体着丝粒探针(CEP-8),并联合免疫荧光化学染色CD45建立免疫荧光化学染色-原位杂交法(CD45-FISH法)鉴定CTC。我们发现,优化后的免疫磁珠包被CD45抗体差减富集CTC法能够稳定的检测到掺入的一个肿瘤细胞。与传统的单纯免疫荧光化学染色上皮角蛋白CK(ICC-CK)法相比,我们所建立的CD45-FISH法检测肺癌患者中CTC的敏感性和特异性分别为83.3%和98.6%；卵巢癌患者中CD45-FISH法检测CTC的敏感性达76.2%,且卵巢癌患者术后7天CTC和血清肿瘤标记物CA125均明显下降。肺癌和卵巢癌患者不同CTC之间FISH杂交信号不同,提示肿瘤细胞的异质性,但是异质性的肿瘤细胞与CTC播散转移是否有关尚需进一步的验证。总之,我们所建立的CD45-FISH法鉴定CTC不依赖EpCAM的表达,与传统的ICC-CK法相比,能较好的检测肺癌、卵巢癌患者的外周血CTC; CD45-FISH法检测CTC有助于监测评估卵巢癌患者手术治疗疗效。本研究第二部分内容是在第一部分研究的基础上继续优化CTC的鉴定方法,在CD45-FISH的基础上同时联合免疫组化染色上皮角蛋白(CK),建立CK/CD45-FISH的方法。CD45-FISH法是一种不依赖上皮细胞抗原表达的CTC鉴定方法,只能鉴别二倍体和多倍体细胞,而联合CK的CK/CD45-FISH法可以同时鉴别CK表达弱化或消失的细胞及FISH二体及多体的细胞。通过在正常人外周血掺入胰腺癌肿瘤细胞系,富集并CK/CD45-FISH法鉴定后,激光显微切割二次分离纯化单个细胞并全基因组扩增(WGA)、酶切富集联合DHPLC技术,我们检测到单个肿瘤细胞中的K-RAS突变。胰腺癌患者外周血经过富集并CK/CD45-FISH法杂交染色鉴定后,根据细胞杂交信号或抗体染色不同,胰腺癌患者外周血异常细胞可分为CK+CD45-CEP8=2、CK+CD45-CEP8>2、CK-CD45-CEP8>2、 CK-CD45-CEP8=2、CK+/-CD45+CEP8=2/>2五个亚群。其中,CK+CD45-CEP8=2、 CK+CD45-CEP8>2、CK-CD45-CEP8>2被定义为CTCs,CK-CD45-CEP8=2被定义为可疑细胞。22例胰腺癌患者中,有2例检测到CK阳性,其中检测到CK+CD45-CEP8=2亚群细胞和CK+CD45-CEP8>2亚群细胞的个数分别为6个、12个/3.75ml和2个、44个/3.75ml；16例检测到CK-CD45-CEP8>2亚群细胞,检测范围为1-14个/3.75ml,中位数为3个/3.75ml；21例胰腺癌患者检测到可疑CK-CD45-CEP8=2亚群细胞,检测范围为1-25个/3.75ml,中位数为5个/3.75ml。4例胰腺癌患者检测到CK+/-CD45+CEP8=2/>2亚群的造血细胞,检测范围为1-4个/3.75ml,中位数为2个/3.75ml。22例胰腺癌患者CTC检测cutoff值为2个/3.75ml时,CTC阳性率为68.18%。综上所述,我们所建立的联合免疫荧光化学染色CK、CD45和FISH CEP-8的方法具备兼顾上皮细胞特异性抗原表达和表达弱化或消失的特点,能够鉴定CTC亚群细胞,亚群细胞的发现再次提示外周血CTC的异质性。并且通过显微切割及酶切富集联合DHPLC技术,我们检测到单个CTC中K-ras基因的突变,这为以后临床单细胞亚群基因分析打下了良好的基础。