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目的:
基因转染技术在临床应用和生物学研究领域都已经取得了很大的发展,但是DNA分子本身不能很好地完成内在化过程,因此,这项技术的关键在于如何使基因有效地进入细胞。研究发现载体系统可以高效转运基因,载体主要包括病毒载体和非病毒载体。由于病毒载体的安全性问题,如诱导免疫反应和感染等限制了它的推广应用,所以尽管非病毒载体介导的转染效率与病毒载体系统相比不够理想,但近年来发展速度很快。
阳离子脂质体是最主要的非病毒载体之一,它具有可自然降解、免疫原性低、可重复转染、易于制备等优点。然而,由于细胞内外所存在的某些独特的生物学障碍,例如血清中DNA核酸酶的降解和吞噬细胞对部分DNA的清除等,如果不了解其作用机制,就很难获得思路上的突破,更不能保证体内试验的成功和临床应用。
在以往的研究中,人们主要关注于细胞对自身体内其他物质的摄取,对于细胞膜上物质跨膜运输的生物学研究比较多,但是针对各种药物例如基因转染中药物载体的运输机制的研究相对较少。本研究旨在将生物学领域细胞膜物质转运与基因传递结合起来,使用不同的抑制剂,抑制细胞膜上的各种摄取路径,即抑制转染过程,然后检测目的基因表达情况,定性以及定量检测抑制作用对基因转染效率的影响,以探究转染过程所涉及的跨膜机制,为更好地了解和克服转运过程的生物学障碍提供参考。
方法:
利用细胞膜上物质运输通道的相关抑制剂,在基本不影响细胞活性的条件下,分别针对不同的路径,抑制细胞对脂质体/DNA复合物的摄取。其中将氯丙嗪、渥曼青霉素作为网格蛋白抑制剂,氯丙嗪可以通过抑制网格蛋白包被小窝在膜上的聚集抑制网格蛋白介导的摄取路径。渥曼青霉素能够影响内体双层外壳结构的形成来减少细胞内内体囊泡,从而抑制摄取过程。高金雀花碱能够通过调节启动小窝蛋白的信号通路抑制小窝蛋白所介导的摄取路径,因此将高金雀花碱作为小窝抑制剂。长春花碱能够影响肌动蛋白骨架正确聚合成肌动蛋白微丝并促进肌动蛋白微丝骨架解离,因此能够抑制微管微丝介导的摄取路径。
加入化学抑制剂后,利用膜通道抑制剂干扰细胞对复合物的摄取,然后测定基因转染的效率。将能够调控绿色荧光蛋白的基因转染到细胞当中,经过一段时间的培养,在倒置荧光显微镜下观察表达蛋白发出的绿色荧光强度的变化。而荧光素酶报告基因表达后,在化学底物发光液的作用下,通过微光检测仪可以定量检测不同抑制剂浓度下转染效率的差异,从而评估这些路径在复合物内在化中的作用。MTT法检测细胞存活率,并确定能够使细胞保持较高存活率的抑制剂浓度,从而比较转染过程对相应路径的依赖性。
结果:
1.绿色荧光蛋白检测结果显示,加入不同浓度的氯丙嗪、渥曼青霉素、高金雀花碱、长春花碱后,随着抑制剂浓度的增大,绿色荧光信号明显减弱。同时加入氯丙嗪和高金雀花碱,或渥曼青霉素和高金雀花碱,对比绿色荧光信号,结果发现同时加入两种药物荧光强度减弱程度增大,但是与单独加入一种药物相比,不同抑制剂之间差别不大。
2.荧光素酶报告基因转染结果显示,加入不同浓度抑制剂后,随着抑制剂浓度的增加,RUL值均具有不同程度的递减趋势。
3.MTT结果显示,将抑制剂浓度控制在一定范围内时,能够保证细胞存活率保持在较高水平,使基因转染检测结果具有较高的可信度。用荧光素酶RUL值与对应的细胞存活率相比发现,在细胞存活率均衡的情况下,随着药物浓度的增大,RUL值仍然保持下降趋势。
结论:
本研究表明,网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用是本文所用阳离子脂质体运载基因进入细胞的主要途径,其中微管微丝介导的吞噬作用也起到重要的调节作用。