论文部分内容阅读
目的：
建立H22荷瘤小鼠模型,观察甘草多糖对荷瘤小鼠NK细胞和调节性T细胞(Treg)亚群及Th1、Th2细胞亚群的影响;观察甘草多糖对树突前体细胞成熟及功能的影响。探讨甘草多糖的免疫调节机制。为中医治疗肿瘤“扶正祛邪”治则的科学内涵提供进一步的实验依据。
方法：
1体内试验
50只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、环磷酰胺治疗组、甘草多糖治疗组,甘草多糖加环磷酰胺治疗组,除正常组外,其余各组建立H22荷瘤小鼠模型,造模第2天各组开始给药,正常组、模型组腹腔注射生理盐水,环磷酰胺治疗组腹腔注射1周,甘草多糖组颈后皮下注射,连续用药14天后,流式细胞仪检测脾脏、肿瘤微环境淋巴结CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例,四甲基偶氮唑盐比色法检测脾淋巴细胞转化率,乳酸脱氢酶比色法检测NK细胞杀伤能力,实时定量聚合酶链反应检测Foxp3、IL-10mRNA表达,酶联免疫吸附试验测定外周血IL-10、TGF-β、IL-12p70、IL-2含量。
2体外实验
从小鼠骨髓中分离单个核细胞(BM-MNCs),在重组鼠粒细胞一巨噬细胞集落因子(rmGM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)的诱导下培养、扩增树突状细胞(DCs),体外培养6天后,分甘草多糖实验组、RPMI1640空白对照组、脂多糖(LPS)阳性对照组,三组分别同时作用48小时。倒置相差显微镜观察细胞形态特征,流式细胞仪分析其表型特征及DCs对FITC-dextran抗原摄取能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激同种异体T细胞增殖能力,酶联免疫吸附试验测定DCs分泌细胞因子IL-12p70,实时定量聚合酶链反应检测药物干预不同时间段DCs TLR4、IL-10、IL-12p70mRNA的表达、酶联免疫吸附试验测定混合淋巴细胞反应48小时细胞上清IFN-γ、IL-10含量及DCs经TLR4中和抗体封闭后,甘草多糖对其分泌IL-12p70的影响。
结果：
1体内试验
用药第七天,甘草多糖的使用对抗了环磷酰胺导致的体重减轻。环磷酰胺组抑瘤率达到54.8％,甘草多糖组抑瘤率达到31.04％。环磷酰胺加甘草多糖组抑瘤率达55.67％。甘草多糖组脾指数较模型组显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。甘草多糖组脾淋巴细胞转化率明显高于环磷酰胺组(P＜0.05)。甘草多糖组NK细胞杀伤能力显著提高,由模型组的30％增加到53％。模型组脾、肿瘤微环境淋巴结Treg水平明显升高,甘草多糖及甘草多糖加CTX治疗组Treg水平较模型组降低。甘草多糖干预后,Foxp3、IL-10mRNA水平与模型组相比显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。Foxp3基因各组间表达趋势与流式检测结果相符。模型组外周血IL-10、TGF-β水平显著上调。IL-12p70、IL-2显著下调。环磷酰胺对TGF-β水平影响不大。甘草多糖有效降低外周血IL-10、TGF-β含量,升高IL-2、IL-12p70水平。
2体外实验
由股骨分离的单个核细胞,经rmGM-CSF、IL-4诱导,甘草多糖干预48小时后,用倒置相差显微镜动态观察细胞形态。至第八天可见细胞进一步增大,胞浆丰富,细胞表面大量毛刺状突起,形态不规则。甘草多糖作用48小时后DCs表面标志分子I-A/I-E、CD80、CD86均高表达,对FITC-dextran的吞噬能力明显减弱。甘草多糖作用后的DCs分泌IL-12p70水平较空白对照组相比明显增高,且呈现时间依赖性,随着作用时间延长,分泌量增加。异体混合淋巴细胞反应表明,甘草多糖刺激的DCs具有极强的刺激T细胞增殖的能力,混合淋巴细胞反应上清液中IFN-γ表达水平明显升高,与空白对照组相比差异显著,IL-10水平与空白对照组相比明显降低,有统计学差异。甘草多糖分别作用于小鼠骨髓来源的树突状细胞3小时、6小时、18小时,结果发现作用6小时、18小时能显著提高DCs TLR4mRNA表达水平(P＜0.01),以作用6小时表达水平最高。甘草多糖作用18小时显著提高DCs IL-12 p70mRNA表达水平。封闭抗体实验显示,抗TLR4中和抗体预孵育树突状细胞1小时后,甘草多糖刺激DCs分泌IL-12p70明显减少,与对照组相比,IL-12p70分泌量减少了35.6％。
结论：
甘草多糖能抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,并对环磷酰胺引起的副作用有部分调整作用。甘草多糖可能通过增强荷瘤机体NK细胞杀伤能力;提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化能力;通过降低荷瘤鼠外周血IL-10、TGF-β水平,升高IL-12P70、IL-2表达调整Th1/Th2免疫平衡,扭转荷瘤机体Th2优势状态;通过上调共刺激分子和MHCⅡ类分子CD80、CD86、I-A/I-E表达,促进DCs IL-12P70分泌,增强同种异基因淋巴细胞增殖,下调对FITC-dextran的吞噬能力诱导TLR4受体介导的树突状细胞成熟;通过上调被活化DCs激活的T细胞分泌IFN-γ水平,下调IL-10表达诱导Th1型细胞分化发挥其“扶正”作用。甘草多糖可能通过改善肿瘤微环境,降低荷瘤小鼠淋巴结CD4+CD25+FOXP3+T细胞比例,通过淋巴细胞归巢以及抑制包括IL-10、TGF-β在内的免疫负调控细胞因子的分泌,实现其抑制免疫负调节的“祛邪”作用。甘草多糖可能是甘草“健脾胃,调阴阳,和营卫”扶正培本药效的物质基础之一。