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苯并(a)芘[B(a)P]是一种常见的环境污染物，尤其在香烟的烟雾、工业及汽车废气中含量较多，因其致癌性而一直受到广泛关注。它的致癌性强，且在体内的代谢转化比较典型，常常作为环境致癌研究的代表。 MicroRNAs(miRNAs)是新近发现的长约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，能够通过与靶mRNA特异性碱基配对引起其降解或抑制其翻译，从而在转录后水平调控细胞分化、增殖、凋亡等生物学过程，为近年来分子生物学研究的热点之一。越来越多的研究表明miRNAs异常表达与人类许多疾病尤其是肿瘤的发生和发展相关，对miRNAs进行基因表达分析对肿瘤的分类、诊断和预后可能具有重要意义。外源性环境化合物是引起许多肿瘤发生的主要原因，因此miRNAs在机体对外源性环境化合物的反应中也可能起着重要作用，但此方面的报道极少。 本研究以小鼠为研究对象，应用高通量测序技术，从全基因组水平观察长期低剂量B(a)P染毒后小鼠肺脏miRNAs表达谱的改变状况，运用RT-qPCR对差异表达miRNAs进行验证，并通过生物信息学分析软件对差异表达的miRNAs进行靶基因及调控通路分析，在此基础上，对miR-20b的生物学功能及靶基因调控进行研究，较为系统的探讨miRNAs在低剂量长期B(a)P暴露过程中的作用及可能机制，为外源性环境化合物健康危害效应提供可能的生物标志。 一、低剂量长期B(a)P暴露小鼠肺脏miRNAs表达谱分析 将清洁级ICR小鼠随机分为两组，每组20只，雌雄各半。染毒组经灌胃途径给予5μg/kg B(a)P，一周两次，共染毒8周，对照组同时给予同等剂量的溶剂橄榄油。染毒结束后继续饲养8周。饲养结束后股动脉放血处死小鼠，收集脏器。分别对染毒组和对照组小鼠肺脏利用Trizol法提取RNA，应用SOLiD TM3高通量测序分析系统进行全基因组miRNAs测序分析。测序结果显示，与对照组相比，染毒组小鼠肺脏miRNAs表达谱发生明显改变，74个miRNAs表达差异在2倍以上，其中32个miRNAs表达明显上调，42个miRNAs表达明显下调，miRNAs整体下调的幅度高于上调的幅度。我们对上调明显的miR-133a及下调明显的miR-20b和miR-181a应用TaqMan探针法进行RT-qPCR分析，结果显示：与对照组相比，染毒组小鼠肺组织miR-133a明显上调，miR-20b和miR-181a明显下调，RT-qPCR结果与测序结果吻合度高，测序结果可靠。 二、差异表达miRNAs生物信息学分析 利用权威的miRNAs分子功能分析软件DIANA-mirPath及KEGG数据库，对第一章筛选出来的差异表达miRNAs进行信号通路分析，结果显示，let-7d、let-7f、let-7i、miR-340，miR-27a、miR-106a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-429、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-130b、miR-301b等miRNAs对KEGG信号通路贡献较大，差异表达miRNAs调控通路主要集中在环境信息处理相关信号转导通路(MAPK、ErbB、Wnt、TGF-β、mTOR signaling pathway等)、细胞通讯及肺癌等多种肿瘤相关通路。对miR-20b信号通路分析结果显示，其调控通路主要集中在环境信息处理信号转导通路(TGF-β、MAPK、ErbB和mTORsignaling pathway)以及非小细胞肺癌等肿瘤相关过程；应用靶基因预测软件TargetScan，miRanda及picTar对miR-20b的靶基因进行预测分析，结果显示，miR-20b可能通过调节与细胞增殖、周期、凋亡及肿瘤发生密切相关的基因参与调控B(a)P介导的致癌过程。 三、miR-20b对16HBE细胞的生物学功能及靶基因调控研究 通过转染anti-miR-20b下调16HBE细胞中miR-20b的表达水平，应用MTT法和流式细胞仪检测miR-20b表达改变对16HBE细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响，结果显示，与阴性对照组相比，转染组细胞增殖能力明显增强，细胞周期G1期下降，S期上升，但细胞凋亡率无显著性改变，说明下调miR-20b表达可以促进细胞增殖，加快细胞周期从G1期向S期转化。通过RF-qPCR和Western Blot技术分别对AKT3基因的mRNA和蛋白表达水平进行检测，结果显示，与阴性对照组相比，转染组细胞AKT3基因的mRNA和蛋白表达水平均无显著性改变，未发现miR-20b对AKT3具有明显调控作用。 综上所述，低剂量长期B(a)P暴露后小鼠miRNAs表达谱发生明显改变，32个miRNAs表达明显上调，42个miRNAs表达明显下调，差异表达miRNAs的调控主要集中在环境信息处理相关信号转导通路、细胞通讯及肺癌等肿瘤相关过程，下调miR-20b可促进16HBE细胞增殖，加快细胞周期从G1期向S期转化。研究为深入了解B(a)P引起的健康损害效应及可能机制提供理论依据。