蜂胶黄酮对小鼠N2a细胞缺氧缺糖所致损伤的保护作用及机理研究

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蜂胶是蜜蜂从胶源植物的树芽、树皮等部位采集的树脂,并混入其上颚腺的分泌物和蜂蜡而合成的一种胶状物质。蜂胶中含有丰富的萜烯类,酚类,黄酮类等生物活性成分,具有极为丰富的药理活性,近年来成为国内外的研究热点。脑血管疾病是常见的临床的多发病,为目前三大致死疾病之一,其致残率、致死率均呈逐年上升的趋势。本文对N2a细胞进行OGD处理4h,复糖复氧24h,建立模拟脑缺血再灌注损伤的细胞模型,以CCK-8法检测细胞存活率为指标,对蜂胶各分离组分及化合物进行活性筛选。实验用蜂胶为山东蜂胶,通过不同浓度乙醇分级提取得到分级醇提物,活性筛选结果显示70%醇提物抗缺血再灌注损伤活性最好。对70%醇提物进行有机溶剂分级萃取,活性结果显示二氯甲烷萃取物活性最高。对二氯甲烷萃取物进行柱层析分离,活性结果表明Fr.3组分活性最高。进一步分离Fr.3纯化制备出松属素、短叶松素、短叶松素-3-醋酸酯、白杨素、高良姜素。对上述五种化合物及文献提及的活性化合物芹菜素进行细胞活性筛选,结果表明各化合物均有很好的抗缺血再灌注损伤活性,其中松属素和芹菜素活性最高,且效果优于阳性对照川芎嗪;短叶松素、高良姜素在中高浓度下显示与模型组有极显著差异;白杨素则在高浓度下显示与模型组有极显著差异,活性较其他化合物弱。短叶松素-3-乙酸酯的活性最弱,故本研究选用此五种高活性化合物进行抗脑缺血再灌注损伤的机理研究。脑缺血再灌注损伤的机理之一是活性氧自由基引起细胞的氧化损伤。蜂胶活性化合物抗缺血再灌注氧化损伤的实验结果表明,松属素、白杨素、短叶松素、高良姜素和芹菜素可以显著降低受损细胞的MDA含量、提高SOD、GSH-Px活性,从而减轻缺血再灌注损伤导致的细胞氧化损伤。其中松属素和芹菜素在三浓度(7.5μM、15μM、30μM)下可极显著提高SOD和GSH-Px的活性,降低MDA含量,活性强于阳性对照川芎嗪。短叶松素、高良姜素和白杨素则在中高浓度下显示出很好的抗氧化活性。脑缺血再灌注损伤的机理之二是钙超载引发细胞凋亡。蜂胶活性化合物调节脑缺血再灌注损伤钙调通道的实验结果表明,松属素、白杨素、短叶松素、高良姜素和芹菜素均可使OGD致损N2a细胞中的游离钙离子浓度大幅下降,通过拮抗细胞内钙超载以减轻细胞的受损程度,从而拮抗缺血再灌注引发的细胞损伤。其中,松属素和芹菜素在三浓度下可极显著降低细胞中的游离钙离子浓度;短叶松素、高良姜素和白杨素则在中浓度或高浓度下极显著降低细胞钙离子浓度。脑缺血再灌注损伤的机理之三是缺糖缺氧引发细胞凋亡。蜂胶活性化合物抗缺血再灌注损伤细胞凋亡的实验结果表明,松属素、白杨素、短叶松素、高良姜素和芹菜素均可有效降低OGD致损N2a细胞的凋亡率,并且通过上调Bcl-2的mRNA的表达水平,下调Caspase-3和Bax的表达水平抑制细胞凋亡通路。其中,松属素和芹菜素可极显著降低细胞凋亡率,活性优于阳性对照;短叶松素、高良姜素和白杨素则在中浓度或高浓度下表现极显著的抗凋亡活性。
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