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中文摘要第一部分SOCSl基因在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中的表达及其甲基化状态的检测研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure, ACHBLF)是指由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)慢性感染的基础上,出现急性肝功能失代偿,继发严重的肝脏损害的严重症候群。ACHBLF在我国慢性乙型肝炎患者中发病率较高,以凝血功能障碍,黄疸,肝性脑病,腹水为主要表现,最终导致多器官功能障碍综合征,病程凶险死亡率极高。目前,细胞因子在肝衰竭的发病机制中的作用日益受到人们的重视,一方面细胞因子可使淋巴细胞活化,参与免疫反应清除病毒；另一方面细胞因子直接参与和加重肝衰竭的演变过程,引起免疫病理反应导致肝细胞的坏死。细胞因子信号转导抑制因子(Suppressor of cytokine signaling, SOCS)1属于SOCS蛋白家族,是一类由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子之一。研究发现SOCS1可通过负反馈环抑制炎症细胞因子信号的传导,在多种免疫反应中发挥重要作用。而HBV可能导致宿主基因甲基化,使SOCS1表达降低,对炎症因子的抑制作用减弱,可能会加重肝脏的炎症损害。研究表明,SOCS1基因的甲基化与慢性病毒性肝炎的炎症、纤维化及抗病毒治疗存在着一定的相关性。但是在慢加急性乙型肝炎肝衰竭中SOCS1基因表达及启动子的甲基化的情况与炎症因子的关系还未有研究。研究目的通过检测ACHBLF患者外周血单个核细胞内SOCS1的mRNA表达情况、启动子区甲基化状态及血浆中相关炎症因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平。并与慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者及正常人进行比较,分析SOCS1的甲基化与肝脏免疫损伤的关系,并初步探讨其在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者发病机制中的作用及临床相关性。研究方法研究对象为2009年6月到2013年3月问在山东大学齐鲁医院和烟台传染病医院就诊和治疗的60例ACHBLF患者,60例CHB患者,以及30例门诊健康体检者作为对照。ACHBLF患者诊断符合亚太肝脏研究协会年会(APASL)标准。采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-PCR)方法检狈ACHBLF、CHB患者及健康对照外周血单个核细胞中SOCSl的表达情况,并通过甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)检测SOCSl启动子区的甲基化状态。应用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测ACHBLF、CHB患者及健康对照血浆中IL-6,IFN-γ和TNF-α的水平。并将SOCS1表达量IL-6,IFN-γ和TNF-α的水平与病情严重指标总胆红素(Total bilirubin, TBIL)、凝血酶原活动度(Prothrombin activity, PTA)、血清丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、HBV-DNA及MELD评分进行相关分析。比较不同SOCS1基因启动子去甲基化状态患者临床指标及预后。统计学分析采用SPSS13.0软件包进行,结果用均数±标准差(x±s)表示,组间差异采用两组独立样本资料的t检验或卡方检验,相关分析采用Pearson线性相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.ACHBLF患者组和CHB患者组血浆IL-6及TNF-α水平明显高于健康对照组(P<0.05)；ACHBLF患者组的IL-6及TNF-α水平在三组中最高,明显高于CHB患者组(P<0.05)。ACHBLF患者组血浆IFN-γ水平明显高于CHB患者组,但与健康对照组相比无明显统计学差异。2.ACHBLF及CHB患者的SOCS1mRNA表达量明显高于健康对照组(P<0.01)；ACHBLF患者组的SOCS1表达量明显高于CHB患者组(P<0.05)。3.ACHBLF患者细胞因子IL-6/IFN-γ/TNF-α水平与TBIL、ALT及MELD评分呈正相关,与PTA呈负相关,与HBV-DNA载量无明显相关性。4ACHBLF患者的SOCS1基因mRNA水平与TBIL、ALT成负相关,与PTA成正相关。另夕SOCS1表达量与ACHBLF患者IL-6/IFN-γ/TNF-α水平分别成负相关。与HBV DNA载量及MELD评分无明显相关性。5ACHBLF患者组的SOCS1基因启动子的甲基化率(35.0%)明显高于CHB患者组(16.7%,χ2=3.52,P=0.003),在30例健康对照中均未发现SOCS1启动子区的甲基化。6.在ACHBLF及CHB患者患者中,甲基化组的SOCS1基因表达量明显低于非甲基化组。ACHBLF患者SOCS1启动子区甲基化组的IL-6/IFN-γ/TNF-α水平、TBIL和ALT水平明显高于非甲基化组,而PTA水平则明显低于非甲基化组。另外,ACHBLF患者甲基化组的MELD积分及死亡率高于非甲基化组。结论SOCS1的表达量与患者的病情严重程度成负相关,SOCS1基因启动子区的甲基化可能参与了相关炎症因子对慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者肝功能的免疫损害。中文摘要第二部分SOCS1基因甲基化及表达与糖皮质激素治疗慢加急性乙型肝炎肝衰竭的研究研究背景慢加急性肝衰竭的发生不同时相依次经受了免疫损伤、缺血缺氧性损伤和内毒素血症的三重打击,其中炎症因子参与的免疫损伤在肝衰竭发生中起着至关重要的作用。肝病尤其是肝衰竭患者普遍存在着肾上腺功能不全的情况,因此早期使用糖皮质激素是治疗慢加急性肝衰竭的方法之一,近年来随着对糖皮质激素不良反应及并发症防治手段的增强,使用糖皮质激素调节患者机体免疫功能、抑制炎性反应已经成为治疗慢加急性肝衰竭的一种选择。第一部分的研究已经证实了SOCS1基因启动子区的甲基化参与了相关炎症因子对ACHBLF患者的肝功能损害。但ACHBLF患者中糖皮质激素对SOCS1的影响及对患者预后是否有提示作用尚未有研究。既往研究资料证实糖皮质激素在体内、体外环境均能够促进SOCS1基因表达并引起甲基化状态改变。据此我们推测对ACHBLF患者采用糖皮质激素治疗可能影响SOCS1对相关的炎症反应的调控。本研究有助于我们认识糖皮质激素治疗对ACHBLF患者SOCS1的表达及甲基化状态的影响,揭示SOCS1对糖皮质激素治疗ACHBLF的提示作用,为提供临床治疗理论依据和新的途径。研究目的通过研究糖皮质激素治疗对ACHBLF患者SOCS1表达,甲基化状态及相关基因、细胞因子的影响,进一步探讨分析SOCS1表达与糖皮质激素激素治疗预后的相关性。研究方法研究对象为2007年12月到2013年5月间在山东大学齐鲁医院就诊和治疗的ACHBLF患者47例,以及30例门诊健康体检者作为对照。ACHBLF患者诊断符合亚太肝脏研究协会年会(APASL)标准。所有ACHBLF患者确诊后均给予糖皮质激素治疗4周。应用RT-PCR法检钡ACHBLF患者治疗前,治疗第3天及治疗28天后SOCSl及干扰素调节受体(interferon regulatory factors, IRF)-1,趋化因子配体(C-X-C motif ligand, CXCL)9, CXCL10, CXCL11的表达情况,应用ELISA技术检测ACHBLF患者和健康对照血浆中IL-6及TNF-α水平,结合患者临床指标,与MELD评分进行相关分析,用甲基化特异性PCR法(Methylation Specific PCR,MSP)测定SOCSl基因启动子的甲基化状态,分析糖皮质激素对SOCSl基因启动子区甲基化状态的影响,探讨SOCSl表达与糖皮质激素治疗的相关性。统计学分析采用SPSSl3.0软件包进行,结果用均数±标准差(x±s)表示,组间差异采用两组独立样本资料的t检验,相关分析采用Pearson线性相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.激素治疗后ACHBLF患者肝性脑病和腹水症状均有明显改善。MELD积分明显下降。2.激素治疗前,ACHBLF患者SOCS1基因mRNA基因表达水平明显高于健康对照(P<0.05)；ACHBLF生存组的SOCS1mRNA表达量明显高于死亡组(P=0.007)。激素治疗第三天,生存组SOCS1表达量上升；治疗第28天,生存组SOCSl基因(?)mRNA表达量明显下降,而死亡组在治疗中及治疗后SOCS1基因mRNA表达量无明显变化。3.激素治疗前,ACHBLF患者血浆IL-6及TNF-α水平明显高于健康对照(P<0.05)；激素治疗后第三天,ACHBLF患者IL-6及TNF-α水平出现明显下降,其中死亡组TNF-α水平明显高于生存组,而两组IL-6水平在治疗第3天无明显差异。激素治疗第28天,生存组IL-6及TNF-α水平均明显低于死亡组(P<0.05)。ACHBLF患者中IFN-γ及STATl相关基因表达量与健康对照相比均有不同程度上升,并在激素治疗3天出现明显下降,在第28天下降均超过30%。4.SOCS1表达水平与MELD积分在激素治疗前、后均存在明显的负相关性。5.激素治疗前,ACHBLF患者TBIL水平明显高于健康对照(P<0.05),PTA水平明显低于健康对照；ACHBLF患者生存组与死亡组TBIL及PTA水平无明显差别(P>0.05)。激素治疗第28天,生存组患者TBIL水平明显下降,PTA明显上升；而死亡组无明显改善。在90天随访结束时采用激素治疗的ACHBLF患者死亡率为52.3%。采用小样本生存率估计(Kaplan-Meier法)对最初存在甲基化及无甲基化的患者分别进行生存分析,发现激素治疗能够明显提高SOCS1非甲基化患者的生存率(P<0.05)。6.激素治疗前有34%的ACHBLF患者存在SOCS1基因的甲基化情况,而30例健康对照中均未发现SOCS1启动子区的甲基化。激素治疗第3天MSP检测ACHBLF患者未发现甲基化状态明显改变,激素治疗第28天检测发现,8名最初存在SOCSl基因启动子甲基化的患者未检测至SOCS1的甲基化状态,其中全部6名最初存在甲基化的生存组患者中有5人出现去甲基化,而l0例死亡组患者中仅有3例出现了去甲基化情况。结论慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中,早期应用糖皮质激素能够明显改善患者肝功能,提高SOCS1基因非甲基化者的生存率,而出现SOCS1甲基化的ACHBLF患者对糖皮质激素治疗效果反应较差,死亡率明显高于无甲基化的患者,预后不良。通过检测ACHBLF患者SOCS1基因甲基化状态,或许可以成为使用糖皮质激素治疗ACHBLF筛选条件。