筛选与鉴定受饥饿胁迫诱导的荔枝幼果脱落相关基因

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荔枝(Litchi chinensis Sonn.)属于无患子科(Sapindaceae)荔枝属(Litchi)原产于我国南部,其果实鲜美,营养丰富,但荔枝花多果少,落果现象严重,这极大地限制了荔枝产业的发展。实验以9年生的‘乌叶’荔枝为材料,对花后35 d的结果母枝进行环割去叶处理,首先考察了该处理对幼果脱落率和乙烯产率以及果皮和种子中糖含量的影响,然后采用基因表达谱测序(RNA-Seq)技术对处理后2d、4d和7d和相应对照的离区、果皮和种子RNA混合样品(分别记为CK2、CK4、CK7、T2、T4和T7)进行测序,并对测序结果进行了相关的生物信息学分析,筛选了与荔枝果实脱落相关的差异基因,最后,采用荧光定量PCR技术鉴定这些差异基因的表达。本研究首次从整个转录组水平上考察了与脱落相关基因的表达趋势,构建了荔枝果实脱落相关基因表达谱,对解析果实脱落的分子调控网络具有重大的意义。主要研究结果如下:  1.田间试验表明,环剥去叶处理后导致果皮与种子的蔗糖、葡萄糖、果糖含量降低,乙烯释放量显著上升,处理后7d的果实累积落果率达到90%,显著高于对照(28%)。  2.采用Hiseq2000测序仪和42bp单端(SE)测序策略对本实验构建的6个样品的cDNA文库(CK2、CK4、CK7、T2、T4和T7)进行测序,分别获得约6.06Mb、5.07Mb、5.23Mb、5.9Mb、5.9Mb和5.9Mb的总reads,其中唯一比对上荔枝参考基因序列上的reads分别占46.63%、46.21%、44.21%、42.46%、38.43%和38.46%。  3.使用RPKM法比较三个取样时期处理与对照(T2-CK2、T4-CK4和T7-CK7)样品间基因表达差异,按照FDR≤0.001,且|log2(差异倍数)|≥2的标准筛选差异表达基因,结果在三组样品间筛选到2200个差异基因。  4.根据表达模式聚类分析,2200个差异基因只在T2-CK2处理组中上调的基因数为211个,下调的基因数为727个;只在T4-CK4处理组中上调的基因数为140个,下调的基因数为273个;只在T7-CK7处理组中上调的基因数为22个,下调的基因数为320个;在这三个处理组中都上调的基因数有45个,都下调的基因数有52个。这些差异基因分为四大组14个亚组:第一组为早期响应饥饿胁迫诱导基因;第二组和第三组分别为中期和晚期响应饥饿胁迫诱导表达基因;第四组是持续响应饥饿胁迫诱导的基因。  5.根据GO功能显著性富集分析和Pathway显著性富集,三个取样时期的处理与对照(T2-CK2、T4-CK4和T7-CK7)样品间的的差异基因主要富集在糖基水解活性、糖基绑定活性、几丁质酶活性、UDP-糖基转移酶活性、糖基转移酶活性、3-磷酸甘油醛脱氢酶活性六大GO-F term(GO-molecular function term,修正P值≤0.05);主要参与苯基丙酸合成、淀粉与蔗糖代谢、次生物质代谢、黄酮类合成、氮代谢、苯丙氨酸代谢等18个代谢途径(Pathway分析,Q值≤0.05)。  6.根据生物学信息学分析结果,同时结合国内外关于器官脱落已有的文献报道,从2200个差异基因中筛选出72个基因,分别以离区、果皮和种子为实验材料进行qRT-PCR表达验证,结果发现56个基因与表达谱结果一致,验证率达到77.8%,这些基因分别是糖代谢相关基因、乙烯合成与信号转导相关基因、生长素相关基因、转录因子与受体蛋白相关基因、细胞壁水解酶相关基因、假性蛋白相关基因,因此,确认这56个基因响应饥饿胁迫诱导的荔枝幼果脱落调控。
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