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本研究采用H6亚型禽流感病毒A/Duck/HuBei/sd170/2008(H6N2)作为免疫原免疫8-10周龄BALB/c小鼠,3次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,分别用全病毒包被ELISA、重组核蛋白(NP)表达蛋白包被ELISA和血凝抑制试验(HI)检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得H6亚型HA特异性McAb4株:4F9、5C7、2C2和3D5;NP蛋白特异性McAb3株:4D6、4C10和186;病毒其他蛋白McAb4株:1F11、3C8、3G7和5C10。对各株McAb腹水效价测定显示4株HA特异性McAbs HI效价依次为13 log2、8 log2、6 log2和8 log2;3株NP蛋白特异性McAbs ELISA效价依次为1:4000、1:16000和1:32000;4株病毒其他蛋白McAbsELISA效价依次为1:128000、1:16000、1:4000和1:4000。染色体计数分析各株杂交瘤细胞的平均染色体数均在97.108之间,符合脾细胞与SP2/0细胞染色体数之和。抗体亚类检测结果显示4株HA特异性McAbs亚类依次为IgG1、IgG2b、IgG2a和IgG1;3株NP蛋白特异性McAbs亚类依次为IgG1、IgM和IgG1;4株病毒其他蛋白McAbs亚类依次为IgG1、IgM、IgG2b和IgM;除4C10和5C10为λ轻链外,其余所有单克隆抗体均为k轻链抗体。
4株具有HI活性的H6亚型特异性McAbs与其他H6亚型AⅣ分离株的交叉血凝抑制反应和中和试验显示,单抗5C7对所选择的毒株全部具有HI活性但只对部分毒株具有中和活性,表明病毒的血凝位点不等同于其中和位点。
HA特异性单克隆抗体的间接免疫荧光试验同样证明所获得的4株单抗具有良好的亚型特异型,并从荧光照片上可以看出,胞浆浓染、胞核发暗,说明HA蛋白在细胞浆中表达。4株单克隆抗体对同一亚型病毒不同分离株之间的抗原差异性和中和活性差异性为禽流感病毒致病机制以及病毒抗原变异的研究提供了一定的物质条件。