论文部分内容阅读
本文以木质层孔菌(Fomes lignosus)为研究对象,首先对其培养条件进行优化,并采用发酵罐进行扩大培养,继而利用盐析、层析等技术将锰过氧化物酶(MnP)分离纯化,并进一步研究该酶的酶学性质。
本文研究多种培养基组分及培养条件对木质层孔菌生产锰过氧化物酶(MnP)的影响。对培养条件进行优化,并采用正交设计法对培养基组分进行优化。优化培养条件为:pH5,温度34℃,装液量150ml,葡萄糖:蛋白胨(C/C)20:1,Mn2+1.5 mmol/L,ABTS0.5mmol/L,转速160r/min。通过正交实验分析培养木质层孔菌的主次因素,同时综合考虑各因素的交互作用。影响酶活因素的主次顺序为:葡萄糖/蛋白胨>转速(r/min)>ABTS(mmol/L>Mn2+浓度。最高酶活力可达1042.76U/L,提高了7倍。较之单纯采用单因素方式优化培养基MnP活力提高了18.4％。
采用发酵罐补料分批培养培养木质层孔菌,发酵罐中溶氧、转速及温度等参数都能得到很好的控制,菌体密度显著提高,摇瓶培养过程中锰过氧化物酶活性最高达到1042.76U/L左右,发酵罐培养的菌体锰过氧化物酶活性可以达到1222.34U/L,提高了17.2％。摇瓶培养过程中菌体菌体干重基本维持在1.7g/L左右,而发酵罐培养过程中的菌体干重最高可以达到7.074g/L,有了大幅度的提高。
在 F.lignosus的锰过氧化物酶分离纯化过程中,粗酶液经过超浓缩及10％饱和度的聚乙二醇分级分离沉淀后,又经 DEAE-cellulose DE52离子交换层析和SephadexTM G-75凝胶过滤层析分析后,可以确定至少有两种锰过氧化物酶存在,分别命名为 MnPⅠ、MnPⅡ。纯化后回收率分别为2.4％和3.6％,测定两锰过氧化物酶的分子量分别为46.26kDa和44.41kDa。在酶学性质方面MnPⅠ和MnPⅡ相似,最适温度都为35℃,对热的稳定性也都在20～40℃。最适pH值为4.5,而对pH值的稳定性两种酶稍有差异,MnPⅠ在pH5.0以下比较稳定,MnPⅡ在pH5.5以下比较稳定。酶的动力学测试以2,6-二甲氧基酚为酶促反应底物测得MnPⅠ和MnPⅡ的米氏常数分别为41.3μmol/L和32.7μmol/L。