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茶树虫害一直是我国茶叶高产和优质的重要限制因子之一,而且茶树被害虫取食后所诱发的防御反应分子机制至今不清,研究尚处于起步阶段。本研究通过cDNA-AFLP技术筛选茶树叶片被茶尺蠖取食后差异表达基因的数量和种类,并运用qRT-PCR对相关差异基因进行验证和表达规律分析,同时对茶树SAMT进行cDNA全长克隆、原核表达及其被茶尺蠖取食诱导后、MeJA处理诱导后的表达特征分析。主要结果如下:
(1)利用cDNA-AFLP技术分析茶树被茶尺蠖取食诱导前后的基因表达谱差异,试验共挑取231条表达差异条带(TDF),通过验证、测序后获得134条(>80bp)EST序列,占挑取条带总数的58%,且序列长度在80-700bp之间。其中,上调与下调TDF数分别为81和53条,各占获得EST序列的60.4%与39.6%。
(2)在GenBank中进行Blastx比对分析表明,获得的TDF序列在已知功能上主要与基础代谢相关,占总数的23.1%,其次与光合与能量,以及蛋白质合成与储藏相关,分别占9.0%与8.2%,再者是与信号传导相关,占6.7%,与抗病与防御相关的占4.5%,其它分别与转录因子、运输、细胞生长与结构相关的占1.5-3.0%;此外,还有6.7%的序列功能不明确,20.2%的没有同源序列。这些序列已经递交到GenBank中,其登录号为JK711037-JK711046、JK714343-JK714436和JK720971-JK721000。
(3)qRT-PCR分析表明,茶树被茶尺蠖取食后3h,与p450(21F1)、乙烯响应因子(22D)、热激蛋白(27L3)和MYB转录因子(28F)相关的TDF表达量皆大幅度上升,其中28F上升幅度最大,为对照的336.2倍,其次为22D,随后依次为21F1和27L3;取食后6h均急剧降低,至48h时,除了27L3略高于对照外,其余都低于对照。
(4)以差异片段26N序列为基础,利用3’/5’-RACE技术从茶树叶片中克隆了一条编码SAMT的cDNA全长,其长度为1542bp,开放阅读框(ORF)1098bp,编码365个氨基酸,并命名为CsSAMT(GenBank登录号:JQ406919),其编码的SAMT理论分子量和等电点分别为41.7kD与5.39;同源比对发现其与金鱼草的AmSAMT同源性最高,为53%,属于甲基转移酶-7超家族,具有SABATH甲基转移酶类的共有性质;蛋白质保守功能结构域预测分析表明,CsSA:MT含有甲基转移酶-7超家族基因相应保守区,如一个保守的SAM的结合位点结构域I[(V/I/L)(L/V)(D/E)(V/I)G(G/C)G(T/P)G],一个SA结合位点结构域[SSYSVHWLS]等。
(5)原核表达结果表明,CsSAMT表达的融合蛋白主要分布于包涵体中,分子量约为59kDa;经过温度和IPTG浓度条件进行优化,以及表达载体的更换后,CsSAMT表达的融合蛋白仍然分布于包涵体中,且没有测出其酶活性。
(6)茶树被茶尺蠖取食后3h,CsSAMT的表达量迅速上升至对照的1.7倍,但是12h后一直处于下调状态,表达量为对照的30-62%;经外源MeJA处理后6h之内,CsSAMT的表达量略有减低,但是9h时,表达量迅速上升至对照的3.0倍,随后表达量一直处于降低状态。