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产溶剂梭菌作为重要的工业微生物，具有底物谱宽泛和产物种类丰富的特点，能够利用多种碳源发酵产生一系列化学品和生物燃料。其中，基于产溶剂梭菌的ABE（Acetone，Butanol，Ethanol）溶剂发酵可产生丙酮、丁醇和乙醇，一度是仅次于乙醇发酵的世界第二大发酵产业。目前，ABE发酵面临的主要问题是淀粉质原料的成本较高和溶剂产量较低，使得其经济性相对于化学合成路线不具备优势。造成梭菌溶剂发酵产量较低的主要原因之一是ABE产物中的丁醇对细胞具有较高毒性，限制了菌体的生长和发酵后期溶剂产量的提高。 鉴于微生物对外界环境压力的耐受以及产物的合成均受到多因素的综合调控，本研究以产溶剂梭菌模式菌—丙酮丁醇梭菌为研究对象，旨在发现和鉴定与丁醇毒性耐受及ABE溶剂合成相关的关键调控因子，并解析其作用机制。 首先，根据丙酮丁醇梭菌在产物丁醇压力条件下的比较转录组数据，找到一对可能参与影响丁醇耐受和溶剂合成的双组分调控系统GstR/K，并通过磷转移实验确认GstR和GstK在同一信号通路上成对地发挥作用。GstR/K的表达强化可促进丙酮丁醇梭菌生长、溶剂合成和耐受性;突变gstR/K基因后，菌株的生长以及溶剂合成速率均有明显延迟，比较转录组数据显示，许多代谢途径基因的转录水平发生了显著变化，包括溶剂合成、群体效应、氨基酸合成和寡肽转运途径等。这一结果提示，GstR/K是一对多效性双组分调控系统。随后，通过体外的凝胶迁移实验(EMSA)，从上述发生转录变化的基因中，找到了调控蛋白GstR直接作用的靶点gstTM（包括gstT和gstM两个共转录基因），这是位于gstR和gstK之间的、一个ABC转运蛋白的编码基因簇。gstTM基因簇的过量表达可促进丙酮丁醇梭菌的生长和溶剂合成，与gstR/K强化表达后的效果一致，表明GstR-GstK通过激活gstTM的表达来影响菌株对丁醇的耐受和溶剂的合成，即发挥了正调控作用。 此外，通过对本实验室前期建立的丙酮丁醇梭菌mariner转座子随机突变体文库中近1000株突变株的发酵表型筛查，得到一株在玉米培养基中溶剂产量显著提高的仃an57突变株。反向PCR分析显示，该突变株中的转座子插入位点是在一个未知功能基因hssp2384的内部。通过对hssp2384基因的定点突变和发酵检测，证明该基因的中断失活确实可导致突变菌株（命名为824hssp2384）的溶剂高产表型，即在以淀粉为碳源的培养基中的ABE溶剂产量达到25-26g/L，比野生型菌株提高约25-30％。转录组分析显示，hssp2384基因失活后，其相邻基因ada2383（编码木聚糖脱酰基酶）的转录水平显著下调，该基因的突变同样导致了菌株的溶剂高产表型，暗示hssp2384和ada2383在功能或作用机制上存在相关性。基于这个推测的进一步筛查发现，真正影响这两个基因功能的是位于hssp2384基因启动子区内一段62bp的DNA序列，而随后的Northern blot分析表明，该段序列编码一段sRNA，即该sRNA通过调控hssp2384和ada2383的表达影响菌株发酵表型。 综上所述，基于组学分析和实验验证，鉴定了丙酮丁醇梭菌中一对正调控溶剂合成和丁醇耐受性的双组分系统GstR/K，并通过体内和体外实验找到了受GstR/K直接调控的下游靶点—编码一个ABC转运蛋白的基因簇gstTM,揭示了这个转运蛋白和菌株耐受丁醇及溶剂高产表型的相关性。此外，通过对丙酮丁醇梭菌转座子随机突变体文库的筛查，获得一株溶剂高产的突变株，并在后续实验中鉴定出导致该表型的一个新型sRNA，命名为sr8384。鉴于双组分调控系统GstR/K和sr8384与溶剂合成能力密切相关，它们的发现及机制的解析不仅可加深对丙酮丁醇梭菌代谢调控网络的认识，还将为工业菌株的遗传改造提供有用的信息和思路。