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结核病是全世界范围内威胁人类健康的主要传染性疾病之一,全球有近1/3的人感染了结核分枝杆菌(M.tb),潜伏感染者若不进行治疗,约有5%-10%的人会在其一生中发展成活动性结核病。潜伏感染者已成为结核病患者的重要来源。目前结核潜伏感染(LTBI)缺乏统一的诊断标准和方法,现有的诊断方法也不能将结核活动性感染与潜伏感染区分开来,亦缺乏有效的预防干预措施,因此,LTBI早期诊断技术的突破和新型疫苗的研发成为当前结核病控制中面临的重要挑战。随着对LTBI研究的深入,已发现某些潜伏感染相关蛋白在潜伏感染者不发病的过程中可能具有免疫保护作用,这些潜伏感染蛋白有可能成为新型的潜伏感染诊断标志物及潜伏感染疫苗的候选靶标,为潜伏感染的诊断及治疗提供新的思路。M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白是LTBI缺氧相关蛋白,目前研究虽然显示二者均可体外刺激结核病患者的全血产生多种细胞因子,但这两种蛋白的免疫学特性尚不清楚,在抗结核免疫中可能发挥的作用尚需进一步研究。本研究对Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的抗原表位进行预测和分析,并对其HLA-A2限制性CTL表位进行鉴定,研究其免疫原性,为研发潜伏感染的免疫诊断试剂和新型疫苗奠定基础。一、M.tb Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的抗原表位的预测应用DNAStar软件包中Protean软件对Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白的氨基酸序列进行分析,综合考虑其二级结构、亲水性、抗原性、表面可能性、肽链骨架柔韧性等多参数预测其B细胞和T细胞抗原表位。结果显示Rv2629蛋白和Rv1736c蛋白具有较多抗原指数较高区段,预测Rv2629蛋白的B细胞表位可能位于22-27、39-51、63-74、100-103、112-119、161-177、199-215、226-236、242-252、345-354、364-374位氨基酸残基,Rv1736c蛋白的潜在B细胞表位可能位于4-11、35-42、82-105、112-124、151-167、191-199、244-255、268-273、331-338、347-361、447-457、526-532、637-652位氨基酸残基。应用SYFPEITHI和RANKPEP两种在线软件预测其Th细胞表位,结果显示Rv2629蛋白可能有20个潜在的Th表位,Rv1736c蛋白可能有40个潜在的Th表位。应用SYFPEITHI法、BIMAS法和Net CTL法预测其CTL表位,经初步预测,选取部分得分较高的野生型候选表位进行氨基酸替换,共预测Rv2629的HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7三种表型的CTL表位共15个,其中HLA-A2限制性CTL表位12个,Rv1736c的这三种表型的CTL表位共23个,其中HLA-A2限制性CTL表位13个。经过预测,Rv2629蛋白的T细胞候选表位占预测表位总数的76.1%,Rv1736c蛋白的T细胞候选表位占预测表位总数的82.9%,这两个蛋白均是T细胞表位占优势的抗原。二、M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白抗原的候选HLA-A2限制性CTL表位多肽的合成预测的25个候选HLA-A2限制性CTL表位多肽用固相合成法合成,合成的多肽经高效液相色谱分析,纯度≥95%。三、M.tb Rv2629和Rv1736c蛋白抗原的候选HLA-A2限制性CTL表位与HLA-A2分子结合的亲和力和稳定性的测定候选表位与T2细胞共孵育,用FITC标记的HLA-A2抗体标记T2细胞分子表面的HLA-A2分子,通过流式细胞仪检测平均荧光强度(MFI),计算荧光指数(FI),FI>1.5表示高亲和力,1.0<FI≤1.5表示中等亲和力,FI≤1.0表示低亲和力;亲和力高的候选表位与T2细胞共孵育,孵育完成后分别于0、2、4、6小时加入抗HLA-A2抗体,应用流式细胞仪检测MFI,计算t=0时的MFI减弱到50%所需的时间(DC50),DC50≥6小时表示稳定性高,4小时≤DC50<6小时表示稳定性处于中等,DC50<4小时表示稳定性较低。亲和力实验结果显示:7条候选表位肽(Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274、Rv2629-p315、Rv1736c-p611-1Y和Rv1736c-p576-1Y)的FI值>1.5,与HLA-A2分子具有较高的亲和力,这7条候选表位肽进行后续的稳定性实验。稳定性实验结果显示:Rv2629-p190-1Y与HLA-A2分子的亲和力较高,但稳定性低;Rv1736c-p611-1Y和Rv1736c-p576-1Y与HLA-A2分子结合的亲和力和稳定性均处于中等水平;Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315与HLA-A2分子有较高的亲和力并具有较高的稳定性,这四条多肽进一步进行体外免疫活性检测。四、M.tb Rv2629蛋白的候选CTL表位多肽的体外免疫活性检测从健康供者、LTBI者和结核病患者外周血中分离得到外周血单个核细胞(PBMCs),用亲和力和稳定性均较高的4个候选表位多肽和重组人白介素-2(rh IL-2)对PBMCs进行刺激,1次/周,每次刺激后3天进行半量换液,同时留取培养上清,用ELISA方法来检测分泌IFN-γ的量,刺激3次后用刺激生成的CTL作为效应细胞,荷肽的T2细胞作为靶细胞,用ELISPOT法来检测分泌IFN-γ的CTL的数量,用LDH法检测CTL的特异性杀伤活性。ELISA结果显示:随着刺激次数的增加,健康供者、LTBI者和结核病患者的PBMCs培养上清中的IFN-γ分泌量均有不同程度的增加,但是在结核病患者中IFN-γ分泌量和增加幅度明显高于其他两组。ELISPOT结果显示:候选表位多肽Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p315和Rv2629-p274刺激结核病患者组的PBMCs生成分泌IFN-γ的CTL的能力显著高于健康供者组和LTBI者组,差异具有统计学意义,p值<0.01。细胞毒杀伤实验结果表明:候选表位肽诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高,当效靶比为100∶1时,Rv2629-p190-2L诱导的CTL对靶细胞的杀伤性最高,杀伤率可达到53.91%,Rv2629-p190-1Y2L和Rv2629-p315诱导的CTL对靶细胞的杀伤效果相近,处于中等水平,杀伤率分别是27.11%和23.91%,而Rv2629-p274诱导的CTL对靶细胞也有一定的杀伤效果,但杀伤率相对较低,仅为13.75%。经过交叉刺激试验,Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L均能识别其母肽Rv2629-p190,说明改造肽刺激生成的CTL仍可识别其野生型抗原。在效-靶细胞反应体系中加入抗HLA-A2单抗,杀伤活性消失,说明这种特异性杀伤具有HLA-A2限制性,因此Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p315和Rv2629-p274是HLA-A2限制性CTL表位。综上所述,本研究联合应用生物信息学技术和体外实验技术发现并鉴定了M.tb Rv2629蛋白的4个9肽片段:Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315为HLA-A2限制性CTL表位,并发现其在结核病患者中具有较高免疫原性,有可能成为结核病免疫治疗及表位疫苗开发的候选靶标。我们将进一步开展体内实验,评价Rv2629蛋白的这4个CTL表位在治疗和预防结核病方面的效果,为开发新型表位疫苗提供实验依据。