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[研究目的]本研究以体外培养的人肾小管上皮细胞(human kidney-2 cells,HK-2 cells)为研究对象。首先,探讨AOPPs对HK-2细胞自噬的影响,其后,探讨AOPPs抑制自噬的具体机制。最后,探讨自噬是否介导了AOPPs诱导的HK-2细胞损伤。[研究方法]1.体外制备无内毒素AOPPs修饰蛋白及鉴定2.人肾小管上皮细胞的培养3.AOPPs对HK-2自噬的影响:分为时间梯度:200ug/ml AOPPs刺激HK-2细胞0,3,6,12,24小时;浓度梯度:对照组,未经修饰的BSA(100 μg/mL),AOPPs(100、200及400 μg/mL)AOPPs刺激HK-2细胞 1 2小时。RT-qPCR法检测自噬相关蛋白BECN1和SQSTM1(p62)的mRNA表达水平,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化,Beclin1,p62的蛋白表达水平。分为对照组,200ug/ml AOPPs组刺激HK-2细胞12小时,免疫荧光法检测激光共聚焦显微镜下LC3B阳性点,透射电子显微镜观察自噬体与自噬溶酶体的数量。4.AOPPs调节自噬的机制:分为时间梯度:200ug/ml AOPPs刺激HK-2细胞0,3,6,12,24小时;浓度梯度:对照组,未经修饰的BSA(100μg/mL),AOPPs(100、200 及 400μg/mL)AOPPs 刺激 HK-2 细胞 12 小时。免疫印迹法检测 p85-PI3K,phospho-AKT(ser473),t-AKT,phospho-mTOR(ser2448),t-mTOR的蛋白表达水平。分为对照组,AOPPs 组(200μg/mL),AOPPs+LY294002 组(AOPPs 200μg/mL+LY294002 10μM)刺激HK-2细胞12小时,RT-qPCR法检测自噬相关蛋白BECN1和SQSTM1(p62)的mRNA表达水平,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3I向LC3II的转化,Beclin1,p62的蛋白表达水平。免疫荧光法检测激光共聚焦显微镜下LC3B 阳性点,透射电子显微镜观察自噬体与自噬溶酶体的数量。5.自噬在AOPPs诱导HK-2损伤中的作用:分为时间梯度:200ug/ml AOPPs刺激HK-2细胞0,6,12,24,48小时;浓度梯度:对照组,未经修饰的BSA(100μg/mL),AOPPs(100、200 及 400μg/mL)AOPPs 刺激 HK-2 细胞24小时。RT-qPCR和ELISA法检测肾小管损伤标记因子KIM-1和NGAL的mRNA及培养上清中的蛋白表达水平。分为对照组,AOPPs组(20μg/mL),雷帕霉素组(雷帕霉素1μM),AOPPs+雷帕霉素组(AOPPs200μg/mL+雷帕霉素1μM),氯喹组(氯喹1 mM),AOPPs+氯喹组(AOPPs 200μg/mL+氯喹 1 mM)刺激 HK-2 细胞 24小时,RT-qPCR和ELISA法检测肾小管损伤标记因子KIM-1和NGAL的mRNA及培养上清中的蛋白表达水平。[结果]1.AOPPs抑制人肾小管上皮细胞自噬RT-qPCR和免疫印迹显示:AOPPs分别下调Beclin1和上调p62mRNA和蛋白的表达,下调LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ蛋白的转化。6h开始出现自噬显著抑制,最佳观察时间为12h,最佳观察浓度为200 μg/ml,与AOPPs在人体中积聚发现的浓度一致。免疫荧光进一步证实:AOPPs组LC3B绿色荧光点较对照组减少;透射电子显微镜观察发现AOPPs组自噬体和自噬溶酶体较对照组减少。未经修饰的BSA对HK-2无此影响。2.AOPPs激活PI3K/AKT/mTOR通路调节自噬免疫印迹结果显示:AOPPs呈浓度和剂量依赖方式诱导PI3K,AKT,mTOR的磷酸化。然而未经修饰的BSA对其表达水平无影响。RT-qPCR和免疫印迹显示,与AOPPs组相比,加入LY294002使LC3-I向LC3-Ⅱ蛋白转化增加,Beclin1和p62基因和蛋白分别上调和下调。免疫荧光和透射电子显微镜进一步证实,与AOPPs组相比,加入LY294002组LC3B阳性荧光点的数量;自噬体和自噬小体的数量增加。3.AOPPs激活PI3K/AKT/mTOR通路抑制HK-2自噬导致其损伤RT-qPCR和ELISA显示:AOPPs呈浓度和剂量依赖方式上调肾小管上皮细胞损伤标记物KIM-1,NGAL的表达,与AOPPs组相比,加入雷帕霉素使KIM-1,NGAL的mRNA和蛋白的表达均降低,差异有统计学意义。加入氯喹使KIM-1,NGAL的mRNA和蛋白的表达均进一步升高,差异有统计学意义。[结论]AOPPs抑制HK-2细胞自噬,其机制可能与PI3K/AKT/mTOR的异常激活有关,自噬抑制介导了 AOPPs导致HK-2细胞损伤。